基于數據挖掘及網絡藥理學探討胡曉梅主任治療真性紅細胞增多癥的用藥規律及機制*

明靜 ，李芋錦 ，楊二鵬 ，王子卿 ，3，劉為易 ，胡曉梅

（1.中國中醫科學院西苑醫院，北京 100091；2.中國中醫科學院博士后科研流動站，北京 100700；3.北京中醫藥大學，北京 100029）

真性紅細胞增多癥（PV）屬于BCR-ABL陰性骨髓增殖性腫瘤（MPNs）范疇，以骨髓及外周血中紅細胞異常增殖為主要特點，同時伴有血紅蛋白、紅細胞壓積、白細胞和血小板增多。本病起病緩慢，臨床主要表現為皮膚黏膜暗紅、皮膚瘙癢、頭暈、頭脹、目赤、耳鳴、手足發麻、疲勞、虛弱、盜汗等癥狀，常伴有肝脾腫大，嚴重者出現心肌梗死、腦血栓、肺栓塞等血栓事件，危及患者的生命。本病晚期可進展為骨髓纖維化（MF）或急性髓系白血病（AML）/骨髓異常綜合征（MDS），少數可伴發淋巴瘤[1]。本病發病率為0.84/10萬[2]，而由于部分患者無癥狀，實際發病率可能高于這一數據。PV屬于獲得性克隆性造血干細胞疾病，發病機制為造血干細胞的惡性擴增，但具體機制尚未明確。在本病的治療上，西醫主要以降低血細胞、預防血栓為主要治療目標，主要藥物包括羥基脲、干擾素、蘆可替尼、阿司匹林等。上述方法多能短期內降低患者的血細胞，但均有潛在的不良反應，且長期療效欠佳[3-5]。

近年來，臨床實踐證明中醫藥在血液病的防治上安全有效。研究名中醫辨治PV的遣方用藥規律在探索本病的有效治療方法上具有重要意義。胡曉梅主任是中國中醫科學院名中醫，從事血液病臨床工作30余年，在中醫治療血液病方面積累了豐富的經驗，尤其在治療PV方面具有中醫特色及顯著療效。筆者曾有幸跟隨胡曉梅主任學習，現收集其門診治療PV的有效方劑202首，應用中醫傳承輔助平臺系統（V2.5），總結用藥規律和診療經驗，并采用網絡藥理學的方法對其方中的核心藥物進行分析，探討其潛在的作用機制，現將結果報道如下，以供同行交流共進。

1 資料與方法

1.1 處方來源 收集2018年4月1日—2020年11月30日中國中醫科學院西苑醫院胡曉梅主任醫師門診治療PV的有效處方202首。

1.2 分析軟件 中醫傳承輔助系統（V2.5）軟件，由中國中醫科學院中藥研究所提供。

1.3 處方錄入與審核 將上述篩選的處方錄入中醫傳承輔助系統，在錄入完成后，由第2人負責錄入數據源的審核，以確保錄入信息的準確性。

1.4 數據分析 通過“中醫傳承輔助平臺”中的“統計報表系統”及“數據分析系統”進行數據的統計分析。

1.4.1 藥物性味歸經統計 在“統計報表系統”，對藥物的性味歸經進行統計分析。

1.4.2 藥物頻次統計 在“數據分析系統”，對錄入處方的藥物頻次進行統計，其中用藥頻次≥40次的中藥進行記錄。

1.4.3 組方規律分析 在“數據分析系統”，對錄入的處方進行組方規律分析，在軟件中將“支持度個數”設為85，“置信度”設為0.8，再分別點擊“用藥模式”“規則分析”“網絡展示”按鍵，即得出相應分析結果。

2 網絡藥理學研究

2.1 藥物靶點預測 提取中醫傳承輔助系統藥物頻次分析得到的前10位的藥物作為核心藥物。運用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）篩選核心中藥的相應化合物[篩選標準：口服生物利用度（OB）≥20%，藥物相似度（DL）≥0.1]，并對化合物進行靶點預測，借助 PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）和SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch）數據庫對預測不到靶點的化合物進行靶標補充。

2.2 PV 疾病基因 在 GeneCards（http：//www.genecards.org/）、DisGenet（https：//www.disgenet.org）、OMIM（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）4 個數據庫，以“polycythemia vera”為檢索詞，搜索與PV相關的疾病靶點。使用在線韋恩圖繪制平臺 Venny2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html，Version 2.1）對 PV 和核心藥物靶點進行映射并繪圖。

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析 將核心中藥的靶點導入R平臺4.0.2，應用clusterProfileR包（3.14.3）[6]，進行基因本體論（GO）分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，根據P＜0.05由低到高篩選出前24條可能性較高的信號通路并進行可視化分析。

2.4 蛋白互作網絡（PPI）的構建與分析 將交集靶點上傳至 STRING 數據庫（http：//string-db.org/），物種選為Homo sapiens，評分條件設定為0.9，繪制蛋白互作網絡圖。

3 結果

3.1 性味歸經分布情況 202首處方中，藥性以寒性使用頻次最高，為1 713次，其次為溫性（696次），平性（656次），涼性（93次），熱性（16次）。藥味以苦味使用頻次最高為1 974次，其次為甘味（1 294次），辛味（1 093次），酸味（195次），咸味（173次），澀味（117次）。藥物歸經以肝經頻次最高，為2 116次，見表1。

表1 歸經分布頻數統計Tab.1 Frequency statistics of drugs’channel tropism

3.2 用藥頻次分析 錄入系統的202首處方，共包含中藥155味，對其進行頻次統計，提示方中頻次大于40次的藥物有29味，具體見表2。本研究將頻次排在前10位的藥物作為胡曉梅主任治療PV的核心藥物，依次為生地黃、柴胡、白花蛇舌草、赤芍、龍葵、半枝蓮、龍膽、夏枯草、黃芩、牛膝。

表2 出現頻次≥40次的中藥頻數統計Tab.2 Chinese medicines with a frequency greater than or equal to 40

3.3 基于關聯規則的組方規律分析 設置“支持度個數”為85，“置信度”為0.8，得到常用藥對48個，包含13味中藥，見表3。得到2味藥物的核心組合28種，3味藥物的核心組合為18種，4味藥物的核心組合2種。此外，進行關聯規則分析，得到用藥規則80條，其中大于0.950以上有19條，見表4。

表3 用藥模式分析Tab.3 Use patterns of drugs

表4 用藥規則分析（置信度保留3位小數）Tab.4 Rule analysis(confidence is set to retain 3 decimal places)

3.4 網絡展示 通過軟件的網絡展示功能，將“支持度個數”設為85，“置信度”設為0.8，對用藥模式中所包含的13味中藥之間的關聯性進行網絡可視化展示，見圖1。

圖1 治療PV常用藥物組合網絡圖Fig.1 Network diagram of drug combinations commonly used to treat PV

3.5 網絡藥理學研究結果

3.5.1 核心藥物包含的化合物、靶點及PV疾病相關基因 按OB≥20%，DL≥0.1的標準在TCMSP檢索到各藥物的化合物分別為生地黃19個，柴胡56個，白花蛇舌草15個，赤芍46個，龍葵7個，半枝蓮41個，龍膽20個，夏枯草19個，黃芩56個，川牛膝11個，去除重復值，總共得到化合物是229個，預測到靶點 378 個。在 GeneCards、OMIM、DisGenet、TTD數據庫檢索到與PV疾病相關的靶點為589個，韋恩圖顯示核心藥物與PV相關的靶點為114個，見圖2。

圖2 韋恩圖Fig.2 Venn diagram

3.5.2 GO功能和KEGG通路富集分析 利用R平臺對核心藥物的靶點進行富集分析，共得到2 579條GO條目，其中生物過程（BP）2422個，細胞組成（CC）37個，分子功能（MF）120個，并根據P值分別選取前10條目進行可視化分析。如圖3所示，核心藥物治療PV主要涉及氧化應激、藥物反應及細胞凋亡等生物過程，它們通過細胞因子受體-配體結合、磷酸化作用、血紅素結合、蛋白結合、激酶調節等分子功能在細胞膜、分泌囊泡等部位發揮作用。

圖3 GO分析條狀圖Fig.3 GO analysis bar graph

KEGG通路分析共富集到157條信號通路，根據P＜0.05由低到高篩選出前24條可能性較高的信號通路，其中 PI3K-Akt、HIF-1、JAK-STAT、P53 等信號通路均是顯著富集的通路，見圖4。

圖4 KEGG富集氣泡圖Fig.4 Bubble diagram of KEGG enrichment

3.5.3 蛋白-蛋白互作網絡圖構建 蛋白-蛋白互作網絡圖通過STRING（www.string.db）構建，總共包含114個節點和429條邊，展示了STAT3、AKT1、TP53、MAPK1、TNF、VEGFA、MAPK14、IL6 等 分 子在作用機制中的核心地位，見圖5A。圖5B展示了蛋白互作網絡節點度值位于前25位的靶點。

圖5 蛋白-蛋白互作圖Fig.5 Protein-protein interaction map

4 討論

PV 屬于中醫“血證”“癥瘕”“眩暈”“頭痛”等范疇，中醫血液病專家于2008年建議將該病規范命名為“血積”[7]。本病的病理改變是血脈瘀阻，氣滯血瘀，肝膽實火，熱入營血等，關于本病的描述散見于各類醫籍中。如《黃帝內經·靈樞》云：“若內傷于憂怒，則氣上逆，氣上逆則六輸不通，溫氣不行，凝血蘊里而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣。”《證治匯補》中載：“熱極沸騰發為斑。”《黃帝內經》云：“大怒則血形氣絕，而血菀于上。”《血證類·臟腑病機論》中曰：“設木郁為火，則血不和，火發為怒，則血橫決，吐血、錯經、血痛諸證作焉，火太甚則頰腫面青，目赤頭痛。”《類證治裁》載：“血從清道出于鼻則為衄，癥多火迫血逆……火亢則治宜清降。”《景岳全書》載有：“血本陰精，不宜動也，而動則為病……概動則多由于火，火盛則迫血妄行。”本病病因分為內、外兩端，外因為外感溫熱邪毒，或外感風寒邪毒入里化熱，傷及血分；內因為七情內傷、情志郁結，或體質陽盛、郁久化熱、傷及血分。國內外眾多的臨床及基礎研究證實中醫藥治療本病的良好效果及獨特優勢[8-10]，但均缺乏廣泛推廣應用。該病病程較長，中醫藥“多靶點”，且可“標本兼治”，可在該病的治療中發揮重要作用。因此，從中醫基本理論和本病的發病機制出發，積極發揮中醫優勢，開發新的中醫治療方法，具有重要的現實意義。朱世榮[11]觀察胡曉梅主任運用經驗方治療MPNs患者40例，結果顯示治療完全緩解12例，占比30%，部分緩解22例，占比55%，2例患者病情穩定，占比5%，且可顯著縮短活化部分凝血活酶時間（APTT），改善患者的高凝狀態，預防血栓形成，臨床療效顯著。

表5 從TCMSP中檢索到的重要化合物Tab.5 Candidate compounds selected from TCMSP

中醫傳承輔助平臺（V2.5）是研究名家醫方的科學、有效工具。本研究采用中醫傳承輔助平臺總結了胡曉梅主任治療PV的用藥規律。藥物頻數統計分析顯示位于前20位的藥物為生地黃、柴胡、白花蛇舌草、赤芍、龍葵、半枝蓮、龍膽、夏枯草、黃芩、川牛膝、炙甘草、白術、土鱉蟲、紅花、澤瀉、桃仁、青黛、梔子、莪術、全蝎，主要包含了血府逐瘀湯、龍膽瀉肝湯以及當歸龍薈丸中的主要藥物。胡曉梅主任認為認為PV的病理因素可歸結為“熱毒”“瘀”“郁”，多屬肝熱血瘀，血氣盛實之證，以瘀血為本，肝火血熱為標，治療上以清肝瀉火，活血化瘀為主，輔以清熱解毒。PV辨證不論虛實，總以瘀血為要，瘀既為病理產物又是致病原因，PV主要表現為紅細胞增多，血液黏稠，常有顏面、唇舌暗紫、目赤、肝脾腫大、舌底靜脈迂曲擴張，脈弦或澀等氣滯血瘀證的表現，故予桃仁、紅花、赤芍、柴胡等藥物活血化瘀，理氣行滯，其中桃仁入心、肝血分，常用于治療瘀血阻滯病證，紅花活血通經，祛瘀止痛，兩者常相須為用；赤芍苦寒入肝經血分，善清瀉肝火，泄血分郁熱而奏涼血、止血之功。氣為血之帥，氣行則血行，柴胡性善條達肝氣，疏肝解郁，善理氣行滯，使氣行則血行。柴胡和赤芍，一入血分，一入氣分，常常相互為用，以行氣活血，在方中同時出現的頻率較高。此外，本病初期患者常有目赤、眩暈等肝陽上亢、肝火旺盛的見癥，故在活血化瘀的基礎上配以瀉肝火平肝陽的藥物可增強療效，方中常用龍膽、夏枯草、赤芍清瀉肝膽實火，天麻、鉤藤、石決明平抑肝陽。龍膽草大苦大寒，為清瀉肝膽實火第一藥，是PV治療的常用藥物，肝體陰而用陽，性喜疏泄條達而惡抑郁，火邪內郁，肝膽之氣不舒，驟用大劑量苦寒降泄之品，既恐肝膽之氣被抑，又慮折傷肝膽生發之機，故用柴胡舒暢肝膽之氣，并能引諸藥歸于肝膽之經，故龍膽、柴胡是胡曉梅主任治療PV方中較常使用的藥對。PV為克隆性腫瘤性疾病，95%以上存在JAK2突變，該突變與本病發生發展相關，具有毒的病性，故胡曉梅主任認為本病的治療應辨病與辨證相結合，在化瘀的同時不忘解毒，常予白花蛇舌草、龍葵、半枝蓮、夏枯草、黃芩、青黛、梔子等清熱解毒且具有抗癌作用的中藥，往往能達到事半功倍的效果。結合西醫病理及中醫病機，胡曉梅主任認為活血化瘀、解毒抗癌應貫穿本病治療的始終。《景岳全書·積聚》：“凡有脾腎不足及虛弱失調之人，多有積聚之病。”本病發病多因虛而生，故予白術健脾益氣，既可防清熱解毒藥物苦寒敗胃，亦可扶正補虛。生地黃是胡曉梅主任治療PV的重要藥物，不僅在方中使用頻次最高，且常用柴胡、赤芍、龍膽作為藥對使用，關聯規則也顯示，方中有龍膽、赤芍、柴胡時，生地黃出現的概率為100%，胡曉梅主任認為方中長期使用清肝瀉火及活血化瘀的藥物可耗傷陰血，故予生地黃養血滋陰，使邪祛而陰血不傷。綜上，借助中醫傳承輔助平臺可以很好地總結胡曉梅主任治療PV的用藥經驗，為臨床用藥提供參考。

此外，本研究基于網絡藥理學的方法，對頻數排在前10位的核心藥物（生地黃、柴胡、白花蛇舌草、赤芍、龍葵、半枝蓮、龍膽、夏枯草、黃芩、川牛膝）進行了分析。PV患者中95%存在JAK2V617F突變[12]，因此JAK2V617F突變成為PV發生和發展的核心問題。JAK2是一種酪氨酸蛋白激酶，能夠介導多種細胞因子的信號轉導，調控細胞增殖。JAK2V617F突變使JAK2持續活化，激活JAK2-STAT3信號通路，使STAT3磷酸化，進而引起紅細胞、血小板以及白細胞的增多[13]。JAK2V617F突變還可通過下游JAKSTAT信號通路激活多種炎性細胞因子產生，包括白介素（IL）-1、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和 γ-干擾素（IFN-γ）等[14-15]。HIF-1可以誘導下游血管內皮生長因子A（VEGFA）表達，促進血管新生，使腫瘤等微環境發生重塑，從而促進腫瘤細胞的增殖、轉移和耐藥[16-17]。研究表明，缺氧誘導因子-1（HIF-1）能夠促進小鼠JAK2V617F突變細胞增殖[18]。MPNs患者的造血干細胞中也發現了HIF-1和血管內皮生長因子（VEGF）的異常升高，并且在羥基脲治療后明顯降低。蘆可替尼可抑制JAK2V617F陽性的HEL細胞的生長，降低HIF-1及其下游靶基因VEGF的表達。而HIF-1抑制劑可選擇性抑制MPN細胞的存活和增殖，而不影響正常細胞[18]，因此，HIF-1有可能是JAK2V617F陽性PV的新治療靶點[18]，調控HIF-1/VEGFA通路有可能成為PV治療的關鍵環節。網絡藥理學結果顯示，共得到核心藥物治療PV的活性成分137個，這些活性成分包含了已知對PV有效的多種機制，例如柴胡中的主要成分柴胡皂苷有很好的抗炎抗腫瘤作用[19]，研究表明其可明顯抑制JAK2V617F陽性的HEL細胞的增殖，誘導細胞凋亡，調控ATK和STAT3分子的表達[20]。槲皮素已被證實能夠通過下調PI3K-Akt通路及JAK-STAT通路誘導血液系統腫瘤細胞凋亡[21]。芹菜素能夠調節 PI3K-Akt，MAPK-ERK，JAK-STAT，NF-κB和Wnt/β-catenin等多條惡性腫瘤相關通路[22]。葛根素能通過抑制PI3K/mTOR信號通路抑制人類乳頭瘤病毒（HPV）陽性宮頸癌細胞的生長和遷移[23]。GO富集分析中，分子功能（MF）富集于細胞因子和蛋白磷酸化激活途徑，與PV發病機制中JAK2病理性磷酸化和IL-6等細胞因子改變有關[24-25]。細胞組件（CC）富集于細胞膜結構和細胞囊泡轉運結構，與PV病理過程中的JAK2受體結構性激活和進一步級聯反應有關[26]。生物過程（BP）富集于活性氧和氧化應激等過程，與PV關于紅細胞氧代謝異常的機制相一致[27]。KEGG 富集于 PI3K-Akt、HIF-1、JAK-STAT、P53等信號通路，皆為PV發病機制中的重要信號通路[18，28-29]。蛋白互作網絡圖顯示，STAT3、AKT1、TP53、MAPK1、TNF、VEGFA、MAPK14、IL6 等分子在作用機制中居核心地位，這些基因有可能是核心藥物治療PV的關鍵靶點。

本研究運用數據挖掘和網絡藥理學分析方法，獲得胡曉梅主任治療PV的高頻核心藥物，并揭示了核心藥物具有多成分、多靶點、多通路治療PV的潛在作用機制，為臨床治療PV提供了參考方案，并為進一步深入研究物質基礎和分子機制提供了思路。