外周血ctDNA中KRAS/BRAF基因突變檢測在晚期結直腸癌中的臨床價值*

馮 芬

廣東省佛山市第一人民醫院胃腸腫瘤內科 528000

結直腸癌是臨床常見的一種異質性疾病，是第三大起源于上皮組織的惡性腫瘤，在中國，結直腸癌的發病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第三位和第四位，嚴重威脅患者生命安全[1]。近年來，結直腸癌的發病率以3.9%/年的速度急劇增加，且呈現出年輕化趨勢[2]。目前，臨床針對結直腸癌的篩查尚缺乏有效手段，且疾病早期無特異性臨床表現，因而多數患者首次確診時便已經處于晚期，甚至已經伴有遠處轉移[3]。已有研究顯示，針對晚期結直腸癌，常規化療方案的治療效果欠佳[4]。隨著結直腸癌中越來越多的基因位點被認識，相應的靶點抑制劑也顯示了有效性好、安全性高及患者依從性高的優點[5]。西妥昔單抗是一種靶向表皮生長因子受體的分子靶向藥物，已獲批用于晚期結直腸癌的一線治療。相關研究發現，對于KRAS/BRAF野生型晚期結直腸癌患者，西妥昔單抗聯合化療的治療效果較為明顯，患者的生存時間得到顯著延長；但是隨著靶向治療時間的延長，不可避免地出現了獲得性耐藥現象，因而已成為臨床急需解決的一項難題[6]。近年來，深入研究發現，KRAS和BRAF基因在結直腸癌獲得性耐藥、疾病進展等方面具有重要作用。因而本研究為了進一步研究可以高效、快捷、穩定且動態地監測獲得性耐藥的機制，通過循環腫瘤DNA(ctDNA)對結直腸癌患者的KRAS和BRAF基因突變情況進行檢測，并對其臨床意義進行探討，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年6月—2020年6月本院收治的晚期結直腸癌患者50例為研究對象，其中男27例(54.0%)，女23例(46.0%)；年齡35～64歲，平均年齡(49.6±5.2)歲；有淋巴結轉移21例(42.0%)，無淋巴結轉移29例(58.0%)。納入標準：(1)經病理檢查確診為晚期結直腸癌，臨床分期為Ⅲb～Ⅳ期，組織學類型為腺癌；(2)原發性結直腸癌；(3)經電子計算機斷層掃描具有可測量病灶；(4)接受至少2個周期的西妥昔單抗聯合化療治療，且至少進行1次評估；(5)腫瘤組織基因檢測為KRAS-WT和BRAF-WT。排除標準：(1)合并其他部位惡性腫瘤；(2)合并嚴重心、肝和腎功能不全；(3)任何曾經接受或正在接受放化療、靶向治療或生物治療；入組前3個月內接受過輸血；無法提供基因檢測樣本(外周血)；合并已知的免疫缺陷病史(如HIV感染史)和/或丙型肝炎等傳染病史。

1.2 治療方法 所有患者均接受西妥昔單抗聯合化療方案進行治療，具體方法：第1天，奧沙利鉑130mg/m2，靜脈滴注；第1～14天，卡培他濱900mg/m2，口服，每3周為1個療程。在化療前1d，接受西妥昔單抗注射液治療，初始劑量400mg/m2，靜脈輸注2h；之后每周維持劑量為250mg/m2，靜脈輸注1h，每3周為1個療程。治療結束后1個月，采用實體瘤療效評價標準(RECIST 1.1)[7]對所有患者的治療效果進行評價，分為完全緩解、部分緩解、疾病穩定和疾病進展。客觀緩解率=(完全緩解+部分緩解)例數/總例數×100%，疾病控制率=(完全緩解+部分緩解+疾病穩定)例數/總例數×100%。

1.3 外周血ctDNA和組織標本中KRAS和BRAF基因突變檢測 血液樣本：采集患者的清晨空腹靜脈血8～10ml置于EDTA抗凝管中，在室溫下置于離心機上，以2 000r/min的轉速離心10min，分離患者血漿。取分離得到的血漿樣本(上清液)，手動抽提其中的DNA，采用NanoDrop 2000核酸定量測定儀對抽提得到的血漿樣本中的DNA進行定量分析；在熒光定量PCR儀上按照突變擴增阻滯系統法對外周血ctDNA中的KRAS和BRAF基因突變情況進行檢測，具體步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。組織標本：收集患者的腫瘤組織和癌旁組織樣本，采用QIAamp FFPE Tissue Kit(Qiagen)抽提腫瘤組織樣本中的基因組DNA。KRAS和BRAF基因突變情況檢測與上述血液樣本的檢測方法相同。突變結果判定：基因突變含量>1%，突變Ct值≥29時，判定為基因突變陽性。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0軟件處理所得數據。計數資料以例數和百分比(%)表示，采用χ2檢驗進行組間比較；采用Kaplan-Meier法進行生存分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.3 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變與晚期結直腸癌患者臨床特征的關系 年齡≥50歲、有淋巴結轉移的晚期結直腸癌患者的KRAS、BRAF基因突變率高于年齡<50歲、無淋巴結轉移的患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征結直腸癌患者外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變率比較[ n(%)]

表2 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變和未突變患者的療效情況[ n(%)]

2.5 外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變與晚期結直腸癌患者預后(中位無進展生存期)的關系 外周血ctDNA中KRAS基因突變患者的中位無進展生存時間為10.30個月(95%CI：8.383～12.217)，KRAS基因未突變患者的中位無進展生存時間為11.30個月(95%CI：9.779～12.822)，KRAS基因未突變患者的生存情況優于KRAS基因突變患者，差異有統計學意義(Log-Rank=4.351，P=0.037)，見圖1。

圖1 KRAS基因突變和KRAS基因未突變患者的中位無進展生存曲線

外周血ctDNA中BRAF基因突變患者的中位無進展生存時間為8.10個月(95%CI：5.051～11.149)，BRAF基因未突變患者的中位無進展生存時間為11.10個月(95%CI：10.403～11.797)，BRAF基因未突變患者的生存情況優于BRAF基因突變患者，差異有統計學意義(Log-Rank=8.143，P=0.004)，見圖2。

圖2 BRAF基因突變和BRAF基因未突變患者的中位無進展生存曲線

3 討論

結直腸癌的發生、進展是一個多基因參與的復雜過程，隨著手術、化療、放療及聯合療法的不斷改善，結直腸癌患者的治療效果及預后都得到了很大提升，但是對于晚期結直腸癌，尤其伴有遠處轉移的患者，療效仍較差[8]。西妥昔單抗是臨床常用的治療結直腸癌的靶向藥物，且在晚期患者中顯示出了較好的治療效果，使結直腸癌的臨床治療進入了靶向治療時代[9]。已有研究表明，下游基因如KRAS、BRAF基因的狀態，可以影響西妥昔單抗治療的療效[10]。相關研究指出，KRAS/BRAF野生型晚期結直腸癌患者可以從西妥昔單抗治療中獲益，但KRAS/BRAF突變型患者卻獲益較小甚至無獲益[11-12]。因而，聯合檢測KRAS和BRAF基因對預測西妥昔單抗在晚期結直腸癌中的療效具有重要意義。

ctDNA是來源于腫瘤細胞的游離DNA，是細胞壞死或凋亡后釋放至外周血的DNA[13]。相關研究顯示，與健康人群相比，腫瘤患者外周血ctDNA水平顯著增高，且與腫瘤組織具有一致性[14]。本研究結果顯示，50例晚期結直腸癌患者腫瘤組織中KRAS、BRAF基因突變率均高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)；但腫瘤組織中KRAS、BRAF基因突變率均與外周血ctDNA相似，差異無統計學意義(P>0.05)，與相關研究結果一致[15]。提示外周血ctDNA與腫瘤組織的一致性較好，臨床可以通過動態監測外周血ctDNA中的KRAS、BRAF基因突變情況，對患者的治療和預后進行合理調整和有效評估。本研究還發現，年齡較大，有淋巴結轉移的晚期結直腸癌患者的KRAS、BRAF基因突變率較高，且KRAS、BRAF基因未突變患者的治療效果和預后均優于KRAS、BRAF基因突變患者。提示KRAS、BRAF野生型患者可以更好地從西妥昔單抗中獲益。但由于本研究的樣本量較小，因而尚需進一步擴大樣本量進行深入研究。

綜上所述，外周血ctDNA與腫瘤組織的一致性較好，在臨床上無法獲取腫瘤組織標本時可行外周血ctDNA替代，且可以通過動態監測外周血ctDNA中KRAS、BRAF基因突變情況對晚期結直腸癌患者的療效和預后情況進行評估，進而有助于臨床醫師為患者選擇個體化治療方案，改善患者預后。