可可堿體外抗氧化活性的研究

吳秀儀， 黃 和， 曹湛慧， 伍 櫻， 黃君梅， 程舒婕， 陳泳恩

（ 廣東海洋大學 食品科技學院， 廣東 湛江 524088）

可可（ Cacao） ， 原產于美洲熱帶的常綠喬木，屬梧桐科， 在赤道南北緯10 °以內的熱帶地區廣泛種植， 與咖啡、 茶葉一起并稱為世界三大軟飲料。可可的果實為可可豆， 是巧克力生產的主要原材料，廣泛應用于甜點、 飲料、 乳制品、 糖果等食品行業，其濃郁芳香的獨特味道深受人們喜愛。 可可豆中主要活性物質為多酚類化合物（ 占5%～15%） 、 生物堿（主要為可可堿和咖啡堿， 占3%～6%）、 礦物質（ 如K、 Ca、 Mg 等）、 維A、 維B、 維E 等。

可可堿（Theobromine； 化學式： 3,7- 二氫-3,7-二甲基-1H- 嘌呤-2,6- 二酮） 是可可中含量最多的生物堿， 含量約為1.5%。 目前， 可可堿主要應用于臨床效用， 現有相關文獻表明， 己酮可可堿有治療短暫性腦缺血癥狀、 增強精子活力、 輔助治療糖尿病[1-2]等功效。 此外， 有關可可堿的其他生物活性和實際應用的報道較少見。

以可可豆為原料， 通過乙醇回流法提取可可堿粗提物， 采用大孔樹脂對粗提物進行純化， 研究可可堿粗提物及純化物的抗氧化活性。 從總還原能力及對3 種自由基（ 二苯代苦味肼基自由基、 羥基自由基、 超氧陰離子自由基） 的清除能力評價可可堿的抗氧化能力， 進一步探索可可堿利用價值， 為可可堿的綜合利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可可豆， 采摘于海南興隆的中國熱帶農業科學院香飲研究所可可種植基地。

可可堿標準品， 上海安譜實驗科技股份有限公司提供， 純度99%； LS-303 型大孔吸附樹脂， 陜西藍深特種樹脂有限公司提供； 鹽酸、 三氯乙酸、 過氧化氫、 無水乙醇、 鐵氰化鉀、 水楊酸、 硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、 焦性沒食子酸等， 均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AD 型高效液相色譜儀， 日本島津公司產品； HH-6 型數顯恒溫水浴鍋， 國華電器有限公司產品； BT100-8 型數顯恒流泵， 上海青浦瀘西分析儀器廠產品； BS-100A 型電腦全自動部分收集器， 上海青浦瀘西分析儀器廠產品； RE-2000A 型旋轉蒸發儀， 上海亞榮生化儀器廠產品； 722 型可見光分光光度計， 上海儀電分析儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 可可豆預處理

將可可豆清洗干凈后剝殼取出果實， 將其烘干、粉碎， 過50 目篩， 得到可可粉， 于冰箱中4 ℃下避光保藏。

1.3.2 可可堿粗提物的提取

取適量可可豆粉， 利用乙醇回流法提取可可粉中的可可堿。 從料液比、 提取時間、 乙醇體積分數3 個方面設計單因素試驗， 得出乙醇回流法提取可可粉中的可可堿較佳的工藝條件為料液比1∶50， 提取時間60 min， 乙醇體積分數30%。 結合單因素試驗的結果進一步設計L9（ 34）正交試驗， 通過極差分析、方差分析及最終的驗證試驗， 得出可可堿提取的最佳工藝條件為料液比1∶60， 提取時間60 min， 乙醇體積分數30%。 采用正交試驗得出的最佳工藝條件提取可可堿， 得到可可堿粗提物。

1.3.3 可可堿粗提物的純化

將提取出來的可可堿粗提物經旋轉蒸發儀減壓濃縮后， 利用LS-303 型大孔樹脂純化可可堿粗提物。 首先， 對大孔樹脂進行預處理。 先用95%乙醇溶液浸泡樹脂24 h 去除其中雜質， 然后進行濕法裝柱， 繼續用95%乙醇淋洗， 直至洗出液變清澈且不出現白色渾濁， 最后用蒸餾水繼續淋洗至無明顯乙醇氣味。 參考楊軍國等人[3]富集咖啡堿的方法并加以改進， 準確稱取200 g 處理過的LS-303 型大孔樹脂（ 濕重） ， 濕法裝柱， 用蒸餾水平衡樹脂12 h， 使樹脂填充緊密， 不得出現氣泡與分層， 否則重新裝柱。取100 mL 經旋轉蒸發濃縮后的可可堿粗提物溶液以1 mL/min 的吸附速度上柱。 待樹脂完全吸附飽和后，用20%乙醇溶液作為洗脫劑以1 mL/min 的流速進行可可堿的解吸附。 洗脫劑的上柱速度與洗脫液的流出速度相等。 每隔3 min 收集一次洗脫液， 每管體積為3 mL， 一共收集80 管。 通過高效液相色譜儀測定分析各小管中洗脫液的可可堿含量， 繪制動態洗脫曲線， 將可可堿含量較高的幾管合并， 作為最終純化物。 最終測得同體積下， 經過大孔樹脂純化后的可可堿質量濃度為純化前的3.31 倍。

1.3.4 可可堿含量的測定

取可可堿標準品用乙醇溶解配制成梯度質量濃度的標準溶液， 用于制作標準曲線來確定樣品中可可堿含量。 利用高效液相色譜儀測定可可堿的含量，并記錄下不同質量濃度的標準溶液的峰面積， 根據數據繪制得到可可堿標準曲線， 得到標準曲線的線性回歸方程和R2。

參考盧金清等人[4]建立的可可堿高效液相色譜（HPLC） 含量測定方法， 高效液相色譜儀器條件為：用型號為Agilent ZORBAX Extend-C18（ 250 mm×4.6 mm， 5 μm） 的色譜柱， 以乙腈- 水（ 體積分數為20%～80%） 作為流動相， 進行等度洗脫， 流速為0.8 mL/min， 檢測波長為275 nm， 柱溫為30 ℃。

將可可堿提取物以轉速3000 r/min 離心10 min，過濾， 將濾液轉至100 mL 容量瓶中以相對應的溶劑定容。 取5 份定容后的溶液分別用高效液相色譜儀測定提取物可可堿的含量。

1.3.5 抗氧化試驗

配制質量濃度為0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0 mg/mL的可可堿粗提液及純化液（ 以可可堿含量計） ， 作為待測樣品溶液， 同理配制質量濃度為0.2， 0.4， 0.6，0.8， 1.0 mg/mL 的維C 溶液（ 以維C 含量計） 作為對照組， 同一條件下與待測樣品溶液共同進行抗氧化試驗， 每組試驗平行進行3 次， 結果取平均值。

（1） 總還原能力的測定。 參考文獻[5]的方法進行可可堿粗提液和純化液的總還原能力的測定。 于10 mL 比色管中加入不同濃度的樣品溶液1 mL、0.2 mol/L 的pH 值6.6 磷酸緩沖鹽溶液2.5 mL、 1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL， 搖勻后于50 ℃恒溫水浴鍋中反應20 min， 冷卻后滴入10%三氯乙酸溶液2.5 mL 使反應終止， 將混合溶液置于離心機中以轉速3 000 r/min離心10 min， 另取干凈的比色管放入離心后的上清液2.5 mL、 0.1%三氯化鐵溶液0.5 mL、 蒸餾水2.5 mL，混合均勻后靜置反應10 min。 最后以蒸餾水為參照，于波長700 nm 處測定吸光度。 用吸光度的高低來衡量樣品溶液的還原性強弱， 吸光度越高， 樣品溶液的總還原能力越高。

（2） 二苯代苦味肼基自由基（ DPPH·） 清除率的測定： 參考文獻[5]的方法測定可可堿粗提液及純化液的清除DPPH·自由基能力。 取3 mL 不同濃度的樣品溶液、 0.2 mmol/L 的DPPH 溶液3 mL 混合均勻， 于黑暗處避光反應30 min， 以無水乙醇為參照， 于波長512 nm 處測定吸光度Ai。 同時， 以樣品溶液3 mL 與無水乙醇混合液3 mL 作為本底組，測定其吸光度Aj， 排除樣品溶液本身顏色影響； 并取0.2 mmol/L 的DPPH 溶液3 mL 與無水乙醇混合液3 mL 作為空白組， 測定其吸光度A0。 以維C 為陽性對照， 樣品溶液對DPPH 自由基的清除率（R1）按下式計算。

（ 3） 羥基自由基（·OH） 清除率的測定： 參考文獻[6]的方法測定可可堿粗提液及純化液的清除OH自由基能力。 于比色管中加入10 mmol/L 水楊酸- 乙醇溶液（ 現配現用） 、 10 mmol/L 硫酸亞鐵溶液（ 現配現用）、 樣品溶液各1 mL， 再加入0.03%過氧化氫溶液1 mL 啟動反應， 混勻后置于37 ℃水浴鍋中反應30 min， 最后將反應溶液于波長510 nm 處測定吸光度Ai。 同時， 取10 mmol/L 水楊酸- 乙醇溶液、10 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、 待測樣品溶液、 無水乙醇各1 mL 混合均勻后測定吸光度值， 作為本底組吸光度Aj；并取10 mmol/L 水楊酸- 乙醇溶液、 10 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、 蒸餾水、 0.03%過氧化氫溶液各1 mL 混合均勻后測定吸光度值， 作為空白組吸光度A0。 以維C為陽性對照， 樣品溶液對OH 自由基的清除率（R2）按下式計算。

（4） 超氧陰離子（O2-·） 自由基清除率的測定：參考文獻[7]的方法測定可可堿粗提液及純化液的清除O2-自由基能力。 于比色管中放入50 mmol/L的pH 值8.2 Tris-HCl 緩沖溶液4.5 mL、 樣品溶液1 mL， 置于25 ℃水浴鍋中保溫10 min， 滴入25 mmol/L 鄰苯三酚溶液0.3 mL（ 現配現用） ， 繼續于25 ℃中保溫5 min， 滴入1～2 滴濃鹽酸終止反應， 最后將反應溶液于波長325 nm 處測定吸光度Ai。 同時， 用蒸餾水1 mL 代替樣品溶液進行上述反應， 作為空白對照，測得吸光度A0。 以維C 為陽性對照， 樣品溶液對O2-自由基的清除率（R3）按下式計算。

1.3.6 試驗數據與處理

所有數據是3 次平行試驗結果的平均值， 數據均利用SPSS 軟件進行整理分析， 利用Origin 2017 軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 可可堿標準曲線

以梯度質量濃度的可可堿標準品做出標準回歸曲線， 所得曲線方程為Y=21 926X+6 751.2， 相關系數R2=0.999 9， 具有較高的可信度。 據色譜圖可得，保留時間為6.45 min 時， 可可堿有特征吸收峰。

可可堿標準曲線見圖1， 可可堿標準品色譜圖見圖2。

圖1 可可堿標準曲線

圖2 可可堿標準品色譜圖

2.2 抗氧化試驗結果

2.2.1 總還原力的比較

各樣品溶液總還原能力的比較見圖3。

圖3 各樣品溶液總還原能力的比較

該方法是基于氧化還原反應的比色法， 以樣品溶液對Fe3+的還原能力作為總還原能力。 由圖3 可知， 在0.2～1.0 mg/mL 的范圍內， 純化前后的可可堿及維C 的總還原能力均隨著質量濃度的增大而增強。總體來說， 可可堿純化液的總還原能力比粗提液強。當可可堿純化液的質量濃度為1.0 mg/mL 時， 平均吸光度達到1.289， 同一質量濃度下的維C 的平均吸光度為1.303， 二者十分接近， 說明可可堿純化液具有良好的總還原能力。 粗提液的總還原能力不及純化液和維C， 最大質量濃度的粗提液的平均吸光度僅為0.999。

2.2.2 對1,1- 二苯基- 2- 苦肼基（DPPH·） 清除能力的比較

各樣品溶液對DPPH·清除能力的比較見圖4。

圖4 各樣品溶液對DPPH 清除能力的比較

DPPH·的乙醇溶液呈紫色， 且在特定波長下有強吸收。 抗氧化劑容易與DPPH·的孤對電子配對，從而造成DPPH·減弱或消失， 因此通過DPPH·的濃度變化可計算樣品對DPPH·的清除率。 利用SPSS 軟件， 對數據進行線性模擬， 計算出三者對DPPH·的半抑制濃度IC50用來比較三者清除DPPH·的能力。計算得出， 可可堿純化液的IC50為0.343， 粗提液為0.562， 維C 為0.23， 即三者對DPPH·的清除能力由高到低排序為維C＞可可堿純化液＞可可堿粗提液。 當質量濃度為1.0 mg/mL 時， 維C 的清除率達98.53%， 純化液的清除率達80.35%， 而粗提液僅為72.48%。 其中， 純化液的清除率與質量濃度具有較好的線性關系， 說明其對DPPH·的清除能力較好。

2.2.3 對羥基自由基（·OH） 清除能力的比較

各樣品溶液對羥自由基清除能力的比較見圖5。

圖5 各樣品溶液對羥自由基清除能力的比較

利用Fenton 反應， 即H2O2與Fe2+混合反應生成·OH， 水楊酸能夠捕捉·OH 并產生有色物質， 該物質在特定波長下有最大吸收， 根據樣品與水楊酸的競爭可計算出樣品的清除率。 計算得出， 維C、 可可堿純化液、 粗提液對羥自由基的半抑制濃度IC50值分別為0.231， 0.402， 0.652。 故三者對羥自由基的清除能力由高到低排序為維C ＞可可堿純化液＞可可堿粗提液。 當質量濃度為1.0 mg/mL 時， 維C 的清除率達98.82%， 純化液的清除率達97.03%， 二者比較接近， 而粗提液僅為76.04%。

2.2.4 對超氧陰離子自由基（O2-·） 清除能力的比較

各樣品溶液對超氧陰離子清除能力的比較見圖6。

圖6 各樣品溶液對超氧陰離子清除能力的比較

在堿性條件下， 鄰苯三酚容易發生自氧化反應生成O2-·， 而O2-·是一種能夠促進鄰苯三酚自氧化的有色的中間產物， 因此測定樣品對其自氧化抑制作用即可測定對O2-·的清除能力。 計算得出維C、 可可堿純化液、 可可堿粗提液對超氧陰離子的半抑制濃度IC50分別為0.311， 0.458， 0.448。 因此， 維C 對超氧陰離子的清除能力強于可可堿粗提液及純化液， 而粗提液與純化液的清除能力較為相近。 當質量濃度為1.0 mg/mL 時， 維C 的清除率最高， 達到99.17%； 純化液達到89.62%， 粗提液達到80.99%。

3 結論

通過乙醇回流法提取可可堿粗提物， 采用大孔樹脂對粗提物進行純化， 研究可可堿粗提物及純化物的抗氧化活性。 結果表明， 可可堿具有總還原能力及對3 種自由基清除能力。 當可可堿質量濃度為0.2～1.0 mg/mL 時， 其自由基清除能力與可可堿濃度呈良好的線性關系， 其中可可堿對DPPH 自由基的清除能力最好（ IC50為0.343） ， 其次為羥基自由基（IC50為0.402） 和超氧陰離子自由基（IC50為0.458） 。因此， 可可堿具有較好的抗氧化活性， 可作為天然抗氧化劑使用。