響應面法優化微波提取毛竹葉黃酮工藝研究

許子競

（ 貴州工程應用技術學院 化學工程學院 天然產物中心， 貴州 畢節 551700）

毛竹（Phyllostachys pubescens） ， 又叫楠竹， 屬多年生常綠植物， 在我國栽培歷史悠久， 主要分布在我國長江以南的丘陵和山麓地區及山村房前屋后。楠竹材質堅韌、 富彈性、 篾性優良， 在傳統應用中，主要用于建筑、 農用、 家具制作和生活用品等。 近年來， 隨著制藥工業和食品加工技術的發展， 科研工作人員對毛竹葉資源有了更深層次的研究和認識。研究表明， 毛竹葉含有黃酮、 茶多酚、 酚酸、 多糖等活性化學成分[1-3]， 其中毛竹葉中總黃酮含量較高，達2%左右[4-5]。 毛竹葉黃酮具有抗氧化、 抗衰老、 防輻射、 抗癌變、 增強免疫力、 降血脂和膽固醇、 抗動脈硬化及抑菌等多種生理功能[6-8]。

從毛竹葉中提取竹葉黃酮， 目前很多企業和一些科研單位， 仍然采用傳統提取技術- 溶劑浸提加外循環提取技術， 但這類提取工藝技術存在對原料利用率低、 過程操作單元多、 能耗高、 提取過程產生大量的廢水和廢渣、 嚴重污染環境等缺點， 妨礙了毛竹葉總黃酮的高效開發。

近年來， 由于微波輔助提取技術在藥品和食品工業的逐步興起， 微波輔助提取高效和快速的新技術， 解決了傳統提取耗時和環境污染的問題， 并且由于微波提取技術成本低、 自動化程度高、 操作性強的特點， 使其較傳統提取工藝優勢更為明顯[9]。 因此， 試驗利用單因素試驗和響應面法相結合， 采用微波輔助提取， 對毛竹葉黃酮的提取工藝進行優化，旨在為竹葉黃酮能更合理地開發和利用， 提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兩年生毛竹葉， 貴州赤化集團提供； 乙醇、 三氯化鋁、 硫酸亞鐵、 水楊酸、 過氧化氫、 焦性沒食子酸、 分析純； 蒸餾水， 實驗室自制； 蘆丁， 上海同田生物技術股份有限公司提供。

JA-1003B 型電子天平， 上海越平科學儀器制造有限公司產品； 旋轉蒸發儀， 上海沃瓏儀器有限公司產品； 真空冷凍干燥機， 上海豫明儀器有限公司產品； TU-1901 型雙光束紫外可見分光光度計， 北京普析通用儀器有限責任公司產品； 微波提取器（3 kW，20 L）， 天水華源微波設備有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛竹葉黃酮的提取工藝

將毛竹葉晾干、 粉碎后， 準確稱取試驗用量樣品， 用3.0 kW 功率的微波提取器提取， 按工藝要求， 加入體積分數為80%的乙醇， 設置工藝要求的料液比、 提取溫度和提取時間， 每批料提取3 次，隨后合并提取液， 將濾液離心過濾、 濃縮、 冷凍干燥， 得干燥試驗樣品， 供檢測使用[10-11]。

1.2.2 單因素試驗

分別考查料液比（1∶9， 1∶12， 1∶15， 1∶18，1∶21， 1∶24， 1∶27） 、 提 取 時 間（ 8， 11， 14，17， 20， 23， 26 min）、 提取溫度（55， 60， 65， 70，75， 80， 85 ℃） 對毛竹葉黃酮提取含量和提取率的影響。

1.2.3 響應面試驗

根據1.2.2 的試驗因素進行Box-behnken 試驗設計， 以竹葉黃酮提取率為響應值（ Y） ， 以料液比（A） 、 提取溫度（B） 、 提取時間（C） 為變量因素，進行響應面優化。

因素與水平設計見表1。

表1 因素與水平設計

根據響應面設計要求， 分別對料液比、 提取溫度和提取時間進行變換： 設A=（ Z1-21）/6， B=（ Z2-75）/10， C=（ Z3-20）/3， 以A， B， C 為變量因素， 竹葉黃酮提取率（Y） 為響應值， 通過Box-behnken 試驗設計方案。

1.2.4 竹葉黃酮含量測定

（1） 蘆丁標準曲線的制作。 參照趙振等人[11]標準曲線制作方法： 準確稱取蘆丁標品5 mg， 放置于25 mL的容量瓶中， 加甲醇溶解， 配制成0.2 mg/mL 質量濃度母液， 從母液中分別移取0， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0，1.2， 1.6 mL 置于10 mL 的容量瓶中， 移取0.1 mol/L三氯化鋁溶液2 mL 加入上述各容量瓶中， 加入甲醇定容， 室溫下放置15 min， 供測定吸光度用。

（2） 毛竹葉黃酮含量的計算。

式中： M——粗總黃酮百分含量， %；

V0——取樣后定容體積， mL；

V1——樣品溶解后定容體積， mL；

V2——移取樣品體積， mL；

A——測定的吸光度；

m——稱取的樣品質量， g。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

蘆丁波長掃描圖見圖1， 蘆丁標準曲線圖見圖2， 三氯化鋁對照的紫外吸收圖見圖3。

圖1 蘆丁波長掃描圖

圖2 蘆丁標準曲線圖

圖3 三氯化鋁對照的紫外吸收圖

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對竹葉黃酮提取率的影響

料液比對竹葉黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 料液比對竹葉黃酮提取率的影響

由圖4 可知， 固定提取溫度75 ℃， 提取時間20 min， 料液比從1∶9（g∶mL） 增到1∶21（ g∶mL）， 黃酮提取率由2.35 %提高到5.63%， 隨后料液比從1∶21（ g∶mL） 達到1∶27（ g∶mL） 時， 黃酮提取率開始略有下降， 可能是由于溶劑量增加，引起提取物濃度稀釋， 進而使試驗檢測結果偏低。因此， 料液比選擇1∶21（g∶mL） 較為適宜。

2.2.2 提取時間對竹葉黃酮提取率的影響

提取時間對竹葉黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 提取時間對竹葉黃酮提取率的影響

由圖5 可知， 固定提取溫度75 ℃， 料液比1∶21（g∶mL） ， 提取時間從8 min 增加到20 min， 黃酮提取率從1.20%上升到5.44%， 隨著提取時間的延續， 黃酮含量略有下降， 可能是由于其他類物質提取的增多， 引起黃酮含量下降， 影響提取率。 因此，提取時間選擇20 min 較為適宜。

2.2.3 提取溫度對竹葉黃酮提取率的影響

提取溫度對竹葉黃酮提取率的影響見圖6。

由圖6 可知， 固定提取時間20 min， 料液比1∶21（ g∶mL） ， 溫度從55 ℃到75 ℃， 黃酮含量從1.98%到5.29%， 然后， 隨著溫度的升高， 黃酮含量略有下降， 可能是隨著提取溫度的升高， 水溶性雜質也增多， 引起黃酮含量質量分數降低， 造成提取率下降。 因此， 最佳提取溫度為75 ℃。

低溫配制工藝對虎杖膏中總二苯乙烯和總蒽醌含量的影響…………………………………………………… 王玉和等（21）：2911

圖6 提取溫度對竹葉黃酮提取率的影響

2.3 響應面優化竹葉黃酮提取工藝

2.3.1 響應面試驗

在2.2 單因素試驗的基礎上， 根據Box-behnken設計進行試驗。

Box-behnken 設計方案與試驗結果見表2， 回歸模型的分析結果見表3。

表2 Box-behnken 設計方案與試驗結果

利用SAS 軟件進行各因素經回歸擬合后， 得到毛竹葉黃酮提取率對料液比、 提取溫度和提取時間的二次多項回歸方程為：

對表3 進行顯著性和方差分析， 該回歸方程（ F=40.25， p＜0.01） 極顯著： 相關系數R2=0.986 4，說明模型可信度在98.64%以上。 失擬項（ F=6.87，p=0.129 8＞0.05） 不顯著， 說明該模型擬合情況較好， 受其他因素影響較小。 回歸方程中一次項A、 B對竹 葉黃酮提取率極顯著（ p＜0.01） ， C 顯著（ p＜0.05） ； 二次項A2、 B2、 C2對竹葉黃酮提取率極顯著（ p＜0.01） ， 交叉項AB、 AC、 BC， （ p＞0.05） 不顯著。 從方差分析因素F 值大小（FB＞FA＞FC） 可知，因素影響的主次順序為提取溫度＞料液比＞提取時間， 綜上分析， 說明該響應面模型有效， 可靠性好。依據模擬方程， 求偏微分， 得A=0.443， B=0.644，C=0.25， 代 入A=（ Z1-21）/6， B=（ Z2-75）/10， C=（ Z3-20）/3， 得Z1=23.656， Z2=81.44， Z2=20.75。

表3 回歸模型的分析結果

2.3.2 交叉作用分析

提取時間和提取溫度相互作用的等高線圖見圖7， 提取時間和料液比相互作用的等高線圖見圖8，提取溫度和料液比相互作用的等高線圖見圖9。

圖7 提取時間和提取溫度相互作用的等高線圖

從3D 曲面進行三因素交互作用分析， 由圖7～圖9 可知， 得到3D 響應曲面為開口向下的凸形曲面， 說明響應值存在極高值。 由圖7 可知， 在料液比達一定值時， 提取時間和提取溫度相互作用較強，在提取溫度75 ℃和提取時間20 min 左右時， 竹葉黃酮提取率存在提取極值點； 由圖8 可知， 在提取時間一定時， 提取溫度和料液比相互作用較強， 在料液比1∶21（g∶mL） 和溫度75 ℃左右時， 竹葉黃酮提取率存在提取極值點； 由圖9 可知， 在提取溫度一定時， 料液比和提取時間相互作用較強， 在提取時間20 min 和料液比1∶21（g∶mL） 左右時，相互作用較強， 竹葉黃酮提取率存在提取極值點。

2.3.3 驗證試驗

將單因素最佳工藝參數進行3 次平行驗證試驗，與模擬方程模型相比， 將最佳單因素修正為料液比1∶24（g∶mL）， 提取溫度81 ℃， 提取時間21 min，竹葉黃酮的最佳提取率為5.78%。

3 結論

以兩年生毛竹葉為原料， 在固定微波功率3.0 kW和80%乙醇條件下提取黃酮， 研究提取溫度、 提取時間和料液比3 個因素對毛竹葉黃酮提取的影響，并用響應面對毛竹葉黃酮提取工藝參數進行優化，并以蘆丁為對照品， 以三氯化鋁對蘆丁紫外吸收峰紅移原理測定黃酮含量。 結果表明， 黃酮最佳提取工藝為料液比1∶24（g∶mL）， 提取溫度81 ℃， 提取時間21 min， 在此條件下， 黃酮的提取率為5.78%，與響應面理論預測值5.81%相比， 其相對誤差為0.51%。 說明該模型可靠， 可以用來指導提取毛竹葉黃酮， 為開發毛竹葉有效成分的利用， 提供了一定的理論依據。