hsa-miR-130家族生物信息分析及在SLE中差異表達(dá)分析①

欒鵬飛 周少嵐 黨 潔 賈 維 馬占兵 霍正浩 （寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系與細(xì)胞生物學(xué)系，寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川750004）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種病因未明，以血清中產(chǎn)生自身抗體為主要特征、可累及多系統(tǒng)多器官的慢性自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡婦女［1］。其病因?qū)W包括環(huán)境和遺傳易感等多種因素［2］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，微小RNA（miRNA）在SLE 的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。miRNA 是一類長(zhǎng)度在18~36 nt，短小而高度進(jìn)化保守的非編碼小RNA 分子，miRNA 的種子序列（seed）通過(guò)直接與靶標(biāo)mRNA 3'末端非翻譯區(qū)（3'UTR）的miRNA 響應(yīng)原件（miRNA response elements，MREs）完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后基因沉默或表達(dá)抑制效應(yīng)，抑制轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)［3］。miRNA 在眾多生物學(xué)過(guò)程中均扮演十分重要的角色，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡，機(jī)體的新陳代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。在眾多miRNA 當(dāng)中，hsa-miR-130 家族是一簇被廣泛研究的miRNA 分子。有研究表明，hsa-miR-130家族與免疫疾病密切相關(guān)，該家族成員包括 miR-130a/b、miR-301 和 miR-454［4-5］。據(jù)估計(jì)，哺乳動(dòng)物基因組都包含2 000個(gè)以上的miRNA［6］，這些miRNAs 調(diào)節(jié)每個(gè)基因組中約60%的基因，甚至有多個(gè)miRNA 調(diào)控某一靶標(biāo)基因的表達(dá)，作用呈現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)化和系統(tǒng)化［7-9］。有效預(yù)測(cè)miRNA 靶基因并結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)手段對(duì)其功能進(jìn)行分析和研究是研究其作用機(jī)制的有效途徑，而基于生物信息學(xué)，使用多種算法工具聯(lián)合可有效降低靶標(biāo)預(yù)測(cè)假陽(yáng)性率［10］。目前，已有研究表明，hsa-miR-130 家族分子與細(xì)胞的增殖、免疫代謝過(guò)程等相關(guān)，但其在SLE發(fā)病中的具體分子作用機(jī)制和臨床表達(dá)特征尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)miRNA 家族保性分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)明確hsa-miR-130a-3p 在SLE 中的表達(dá)特性，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)hsa-miR-130 家族靶基因，并對(duì)其靶基因集合進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）富集分析、信號(hào)通路（KEGG）富集分析及靶標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析（PPI）等研究，以期為深入研究hsa-miR-130家族在SLE中作用機(jī)制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：2019001），所有參與者均提供書面知情同意書。選取2018 年1 月至2018 年11 月寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬風(fēng)濕科醫(yī)院收治的18 例SLE 患者作為病例組（男、女各9 例），樣本納入標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵守1982年和1997 年修訂的美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)SLE 分類標(biāo)準(zhǔn)（Hochberg，1997）。另按性別和年齡與SLE 患者組相匹配，選取同期18 例沒(méi)有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎臟疾病、結(jié)締組織疾病或原發(fā)性干燥綜合征病史的健康個(gè)體作為對(duì)照組。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量表達(dá)分析 RT-qPCR 法檢測(cè)臨床SLE 患者及對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）中hsa-miR-130a-3p 的表達(dá)水平，所用引物見(jiàn)表1。采用天根總RNA 柱法提取試劑盒（DP118）提取18 例SLE 患者及健康志愿者PBMCs 中的總RNA。使用莖環(huán)引物逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃保存。目標(biāo)基因的表達(dá)水平檢測(cè)使用SYBR-Green 法，以cDNA 為模板，擴(kuò)增條件：95℃ 預(yù)變性30 s；95℃ 變性5 s；62℃ 退火30 s，72℃延伸30 s，重復(fù)40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)處理以GAPDH 為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 RT-qPCR primer sequences

1.2.2 進(jìn)化保守性分析使用 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、UCSC（http：//genome.ucsc. edu/）、miRbase（http：//www. mirbase. org/）等在線數(shù)據(jù)庫(kù)查找hsa-miR-130 家族miRNA 前體的堿基序列及染色體定位，經(jīng)DNAMAN 軟件多序列連配分析，比較其在物種間的進(jìn)化保守性。

1.2.3 靶基因預(yù)測(cè)和富集分析 分別使用不同算法的靶基因預(yù)測(cè)軟件miRanda（http：//www. microrna.org/）、targetscan7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）和 PicTar（https：//pictar. mdc-berlin. de/）聯(lián)合預(yù)測(cè)的基因作為進(jìn)一步分析的靶基因數(shù)據(jù)集。應(yīng)用軟件Cytoscape3.7.2 的CluoGO 插件進(jìn)行靶基因GO 功能富集分析，分別投射細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）三大基因本體術(shù)語(yǔ)。使用R 包ClusterProfilter 進(jìn)行KEGG 通路富集分析。

1.2.4 靶基因互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）分析 將聯(lián)合預(yù)測(cè)靶基因名稱列表提交至 STRING（https：//string-db.org/）蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為Human species 執(zhí)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。在Cytoscape 中將STRING 輸出的網(wǎng)絡(luò)圖源文件打開(kāi)，使用MCODE插件從網(wǎng)絡(luò)圖中找到關(guān)鍵基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0 軟件分析數(shù)據(jù)，所有計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，ClusterProfilter 富集性分析采用Fisher 確切概率法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE 生化指標(biāo) 臨床SLE 患者年齡、性別、系統(tǒng)性狼瘡疾病活動(dòng)度指數(shù)（SLEDAI）評(píng)分、血沉（ESR）、抗ds-DNA 抗體水平（Anti-dsDNA）、抗核抗體（ANA）、超敏反應(yīng)蛋白（CRP）等臨床指標(biāo)如表2所示。統(tǒng)計(jì)分析表明，男、女性患者免疫學(xué)檢查結(jié)果ANA 均為陽(yáng)性、抗dsDNA 均大于100.0，且二者同時(shí)存在，特異性高；不同性別間SLEDAI 評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 SLE患者的臨床特征（）Tab.2 Clinical characteristics of SLE patients（）

表2 SLE患者的臨床特征（）Tab.2 Clinical characteristics of SLE patients（）

Note：ESR reference range：adult males 0~15 mm/ h，adult females 0~20 mm/ h；anti-dsDNA reference range：0.00~7.00；ANA reference range：negative（-）；CRP reference range：0.00~2.87.

CRP（mg/ L）12.46±4.28 4.55±16.43 35.00 0.627 SLE Samples Female Male t/ T P Age（year）47.67±4.78 37.33±4.26 1.613 0.126 SLEDAI 12.89±0.78 14.33±1.00 3.414 0.004 ESR（mm/ h）29.33±5.47 26.44±26.10 28.50 0.289 Anti-dsDNA（U/ ml）134.99±96.12 121.73±52.08 40.00 0.965 ANA++--

2.2 hsa-miR-130a-3p 在SLE 患者組與對(duì)照組中的表達(dá) hsa-miR-130a-3p 的RT-qPCR 曲線和溶解曲線如圖1A、B，結(jié)果表明引物特異性較高，內(nèi)參基因和目的基因擴(kuò)增效率均大于85%，Ct 值范圍在18~30個(gè)循環(huán)以內(nèi)，能夠用于miRNA差異表達(dá)的有效檢測(cè)。與健康對(duì)照組相比，SLE 患者外周血PBMCs 中hsa-miR-130a-3p 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1C，P＜0.05）。

圖1 hsa-miR-130a-3p RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection results of hsa-miR-130-3p RT-qPCR

2.3 hsa-miR-130 家族進(jìn)化保守性分析 miRbase分別檢索人（hsa）、黑猩猩（ptr）、大鼠（rno）、小鼠（mmu）等其他物種miRNA 前體序列，多序列比對(duì)結(jié)果顯示，hsa-miR-130 種子區(qū)序列AGTGCAAT 在脊椎動(dòng)物中高度保守，見(jiàn)圖2。

圖2 不同物種中hsa-miR-130前體序列中的種子序列Fig.2 Seed sequences of precursor of hsa-miR-130 in different species

2.4 hsa-miR-130的靶基因預(yù)測(cè) 采用不同算法軟件交叉預(yù)測(cè)miRNA 靶標(biāo)，可明顯提高預(yù)測(cè)作用靶標(biāo)的陽(yáng)性率。檢索 PicTar、Targetscan 及 miRanda 數(shù)據(jù)庫(kù)，參數(shù)設(shè)置默認(rèn)，結(jié)果分別得到483、1 028和4 470個(gè)靶基因，取三者預(yù)測(cè)靶基因的交集后共得到285 個(gè)靶基因集合用于后續(xù)功能富集分析（圖3）。

圖3 hsa-miR-130家族靶基因預(yù)測(cè)情況Fig.3 Prediction of hsa-miR-130 family target genes

2.5 hsa-miR-130 靶基因功能注釋及信號(hào)通路分析 通過(guò)Cytoscape CluGO 插件對(duì)285 個(gè)靶基因進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果表明，靶基因涉及的細(xì)胞成分（CC）主要包括Ccr4-Not 復(fù)合物、膜細(xì)胞器及cul3 環(huán)泛素連接酶復(fù)合物等；在生物學(xué)過(guò)程（BP）上則與細(xì)胞通訊、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)的信號(hào)通路等密切相關(guān)；分子功能（MF）包括多種蛋白酶的活性、轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)、離子通道的活動(dòng)等；采用R 包ClusterProfilter 對(duì)靶基因集合進(jìn)行生物通路富集分析，其中45個(gè)靶基因具有相關(guān)生物通路。以人的所有基因?yàn)楸尘盎颍l(fā)現(xiàn)hsa-miR-130的靶基因富集于細(xì)胞VEGF/VEGFR信號(hào)通路、雌激素膜受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及與細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)的其他信號(hào)通路中（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 hsa-miR-130靶基因的GO功能分析（Top10）Fig.4 GO function analysis of hsa-miR-130 target gene（Top10）

2.6 靶基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（TFBS）分析 對(duì)hsa-miR-130 預(yù)測(cè)的共同靶標(biāo)mRNA 啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行富集分析，結(jié)果如圖5 所示，有眾多與SLE發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子?；虮磉_(dá)的調(diào)控是疾病發(fā)生發(fā)展的核心，而基因表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TF）實(shí)現(xiàn)，miRNA 作為重要的轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控因子，在各種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而hsa-miR-130如何影響眾多轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，有待更深層次的探究。

圖5 hsa-miR-130共同靶標(biāo)mRNA 啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子富集分析Fig.5 Enrichment analysis of transcription factors in mRNA promoter region of common target of hsamiR-130

2.7 靶基因互作網(wǎng)絡(luò) 聯(lián)合預(yù)測(cè)得到hsa-miR-130靶基因共285個(gè)，根據(jù)STRING蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)信息可構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步從該P(yáng)PI網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行聚類從而構(gòu)建功能模塊，使用Cytoscape 插件MCODE從網(wǎng)路圖中找到排名前20 的關(guān)鍵基因，結(jié)果如圖6所示。通過(guò)互作網(wǎng)絡(luò)分析及聚類分析以發(fā)現(xiàn)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，如ESR1、SKP1、KIT 等與SLE 發(fā)病密切相關(guān)。其中女性性類固醇——雌二醇通過(guò)其受體（ESR）發(fā)揮作用，致使SLE 出現(xiàn)性別二態(tài)性的機(jī)制至今尚不明確，而ESR1 作為互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因受hsa-miR-130的調(diào)控，能否導(dǎo)致疾病的進(jìn)展有待深入研究；另外KIT 基因位于B 細(xì)胞受體信號(hào)通路（BCR）上游，而作為hsa-miR-130靶基因之一的KIT 或?qū)⑹芷湔{(diào)控進(jìn)而影響下游STAT 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，或有可能激活炎癥通路，導(dǎo)致SLE。

圖6 PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因（Top20）Fig.6 PPI network key genes（Top20）

3 討論

自 1993 年 LEE 等［11］在研究線蟲發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)首個(gè)miRNA 基因以來(lái)，越來(lái)越多的miRNA 被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，其功能及在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮的作用也受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前為止，共有超過(guò)48 000個(gè)miRNAs 被識(shí)別，包括2 693 個(gè)人類起源的mi-RNAs［12-13］。由于單個(gè) miRNA 可靶向多達(dá) 400 種不同的mRNA，因此預(yù)測(cè)超過(guò)一半的人類基因直接受miRNA調(diào)控［8］。有研究表明，miRNAs表達(dá)異常是許多病理過(guò)程的特征，包括癌癥、代謝紊亂、炎癥、心血管、神經(jīng)發(fā)育及自身免疫性疾?。?4］。

研究表明，SLE 患者中存在大量異常表達(dá)的miRNAs，參與了SLE 免疫異常和器官損傷，而應(yīng)用miRNA 治療 SLE 具有重要臨床意義［1］。既往文獻(xiàn)報(bào)道hsa-miR-130 在急性心肌梗死、非小細(xì)胞肺癌、膜性腎病及其他腫瘤中下調(diào)發(fā)揮作用（表3），且已有研究報(bào)道hsa-miR-130a 參與眾多重要的生物學(xué)過(guò)程［15-18］。對(duì) hsa-miR-130 預(yù)測(cè)的共同靶標(biāo) mRNA 啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示出眾多受其影響的轉(zhuǎn)錄因子，其中參與了細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等重要生命過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子Sp1，是目前研究極為廣泛的系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子，該分子可影響細(xì)胞周期調(diào)控分子的表達(dá)和生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及細(xì)胞的凋亡過(guò)程，從而對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用［19］；FOS則在研究中被證明與其他基因存在通過(guò)不同途徑間的相互作用，以及作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子與SLE 發(fā)病過(guò)程密切 相 關(guān)［20-21］；EGR1 曾 被 報(bào) 道 與 IGF-2、APEX、SRD5A1、CD44 和 EGFR 等基因相互作用，并通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活這些基因在B 細(xì)胞中的表達(dá)，加速SLE病情的發(fā)展，也被確定與SLE的發(fā)病密切相關(guān)［22］。

表3 hsa-miR-130調(diào)控靶基因參與人類的部分疾病Tab.3 hsa-miR-130 regulatory target genes are involved in some human diseases

此外，有文獻(xiàn)指出，hsa-miR-130a可與miR-326、miR-155、miR-210 共同作為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者生存的預(yù)后和預(yù)測(cè)標(biāo)志物［4］；也有報(bào)道表明hsamiR-130a-3p可能參與狼瘡性腎炎發(fā)病，但其具體分子機(jī)制尚不明確［23］。此外有研究表明，在SLE 患者中，hsa-miR-130a-3p 可通過(guò)上調(diào)Klotho（抗衰老基因）保護(hù)脂多糖誘導(dǎo)的腎小球細(xì)胞損傷［23］；與hsamiR-130a-3p 同家族的另一分子hsa-miR-130b-3p 曾在WANG 等［24］的研究中被發(fā)現(xiàn)與蛋白尿和狼瘡性腎炎的慢性腎損傷指數(shù)密切相關(guān)，雖然沒(méi)有直接證據(jù)證明循環(huán)中的hsa-miR-130b-3p 是否會(huì)被腎小管上皮細(xì)胞吸收并影響其功能，但有研究指出，從間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的微泡可通過(guò)改變mRNA 和mi-RNA 水平從而保護(hù)由缺血再灌注損傷所引起的急性腎損傷和隨后出現(xiàn)的慢性腎損傷，因此增加體內(nèi)循環(huán)hsa-miR-130b-3p 的水平能否有效改善病情值得進(jìn)一步研究［25］。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)hsa-miR-130的靶基因，并對(duì)其靶基因進(jìn)行GO注釋及KEGG通路分析。預(yù)測(cè)得到的285 個(gè)hsa-miR-130 的靶基因存在于細(xì)胞的各個(gè)組分中，具有細(xì)胞周期調(diào)控、DNA表達(dá)調(diào)控和自噬調(diào)節(jié)等分子功能，并富集于細(xì)胞VEGF/VEGFR 信號(hào)通路等其他信號(hào)通路，而眾多文獻(xiàn)表明SLE 患者皮損中VEGF 蛋白表達(dá)水平增高，提示VEGF 蛋白在SLE 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用，但SLE 患者低表達(dá)的hsa-miR-130a 與VEGF 信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因Flt-1 和KDR 是否存在直接靶向關(guān)系有待進(jìn)一步驗(yàn)證［26-27］；此外，KEGG通路分析顯示雌激素膜受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖、分化和免疫系統(tǒng)中具有重要作用，而這也在相關(guān)研究中得到證實(shí)［28］。此外，據(jù)報(bào)道，異常的mi-RNA 表達(dá)模式是由雌激素引起的，且越來(lái)越多的miRNA 被鑒定出受雌激素調(diào)控，其中包括miR-146a和 miR-155，都與 SLE 密切相關(guān)［28-30］。有研究表明SLE 患者血漿中雌激素水平與 IL-6、IL-21、IL-23 密切正相關(guān)，女性SLE 患者雌激素水平較健康女性顯著升高。異常雌激素可能通過(guò)作用于miR-21、miR-25及miR-186等分子參與干擾素途徑在SLE 中發(fā)揮重要作用［31］，而在 TargetScan Human 7.2 中可查到ESR1基因與hsa-miR-130家族種子區(qū)域的配對(duì)類型均為7mer-m8，并且二者與hsa-miR-130 家族非種子區(qū)域3'端存在不同長(zhǎng)度的互補(bǔ)位型（表4）。hsamiR-130 家族種子區(qū)域與ESR1 基因的3'UTR 完全互補(bǔ)配對(duì)可增強(qiáng)hsa-miR-130對(duì)ESR1基因的沉默效果，故可利用hsa-miR-130 與ESR1 基因的高特異性來(lái)研究hsa-miR-130對(duì)ESR1基因富集的雌激素代謝通路（如SLE 的激素治療）。此外，本文對(duì)hsa-miR-130 家族靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)度量分析后，雌激素受體（ESR1）作為PPI 核心關(guān)鍵基因，生物信息學(xué)分析顯示其可能受hsa-miR-130調(diào)控從而參與SLE發(fā)病，但其通過(guò)哪種機(jī)制發(fā)揮作用有待深入驗(yàn)證。

表4 ESR1基因3'-UTR與hsa-miR-130家族結(jié)合位點(diǎn)Tab.4 Binding sites of ESR1 gene 3'-UTR with the hsa-miR-130 family

目前有關(guān)hsa-miR-130 在SLE 發(fā)病中的分子機(jī)制尚未揭示。本文檢測(cè)了SLE患者及健康人群外周血 PBMCs 中 hsa-miR-130a-3p 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn) hsa-miR-130a-3p在SLE患者中明顯下調(diào)，結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，提示該分子可能參與SLE的發(fā)病，為進(jìn)一步研究miRNA參與SLE的發(fā)病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。