蒜氨酸對(duì)金葡菌感染家兔免疫因子表達(dá)與吞噬細(xì)胞吞噬功能的影響①

李明強(qiáng) 代露露 周艷萌 韓志俊 裴天容 （遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微免實(shí)驗(yàn)室，遵義563000）

大蒜是一種古老的食藥兩用植物，在我國(guó)已有兩千多年的種植歷史，其性味生辛熱、熟辛溫，具有行氣滯、暖脾胃、攻冷積、解毒殺蟲的功效。近年大蒜及大蒜制品風(fēng)靡全球，被譽(yù)為天然“藥用植物黃金”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，大蒜素具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能、防治心血管疾病以及降低血脂、血糖等多種生物活性［1-3］。大蒜素主要包括二烯丙基一硫化合物（DAMS）、二烯丙基二硫化合物（DADS）、二烯丙基三硫化合物（DATS）、二烯丙基四硫化合物（DATTS）等脂溶性成分，具有特殊的刺激性［4］。大蒜素的脂溶性使大蒜素注射液配制必須使用有機(jī)溶劑、助溶劑、增溶劑，給機(jī)體帶來毒副作用［5-8］；局部高濃度大蒜素的刺激性致使組織細(xì)胞損傷、形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理機(jī)能改變；導(dǎo)致大蒜素注射液臨床使用受限，達(dá)不到預(yù)期臨床效果。為此人們將目光轉(zhuǎn)移到大蒜素前體物質(zhì)——水溶性成分蒜氨酸，蒜氨酸與蒜酶同時(shí)使用開啟了對(duì)蒜氨酸的研究進(jìn)程，原理是蒜酶將蒜氨酸分解成大蒜素發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，現(xiàn)有研究報(bào)道表明，蒜氨酸與蒜酶同時(shí)使用能降低環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫功能的損傷［9］。周圓等［10］將蒜氨酸與蒜酶制備成雙層包芯片，其制劑進(jìn)入腸道后由蒜酶將蒜氨酸分解成大蒜素，通過腸道進(jìn)入血液后發(fā)揮藥效。有研究發(fā)現(xiàn)高濃度大蒜素引起腸黏膜炎癥反應(yīng)，黏膜細(xì)胞受損，使腸黏膜萎縮，杯狀細(xì)胞減少［6］，尚無雙層包芯片應(yīng)用的研究報(bào)道。近年對(duì)蒜氨酸化學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)的研究表明，蒜氨酸在高溫條件下，能發(fā)生熱分解作用，形成大蒜素；蒜氨酸在體內(nèi)經(jīng)代謝酶的作用也能分解為大蒜素［11-13］。單獨(dú)對(duì)蒜氨酸藥理作用的研究較少，有研究報(bào)道用蒜氨酸對(duì)小鼠灌胃能提高小鼠免疫功能［14］。本文就金黃色葡萄球菌（后簡(jiǎn)稱金葡菌）感染家兔形成膿腫，應(yīng)用蒜氨酸治療，觀察蒜氨酸對(duì)家兔吞噬細(xì)胞功能與免疫因子表達(dá)的影響，以探討蒜氨酸對(duì)細(xì)菌感染家兔免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 家兔購(gòu)自遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；蒜氨酸：農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買紫皮大蒜參照文獻(xiàn)［15］分離提取，配制成100 mg/ml 蒜氨酸溶液，調(diào)節(jié)pH7.4；金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003 購(gòu)自中國(guó)普通微生物保藏管理中心；異硫氰酸熒光素FITC購(gòu)自蘇州亞科科技股份有限公司（貨號(hào)：3326-32-7）；青霉素購(gòu)自中諾藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：0121804114）；兔IL-2、兔 IL-7 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海康朗生物科技有限公司（批號(hào)：EDL201908164、EDL201908164）；紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司（貨號(hào)：R101）。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌感染家兔模型的建立與蒜氨酸治療 家兔60 只（清潔級(jí)），雌雄不拘，體重2~3 kg，隨機(jī)分為6組，每組10只。隨機(jī)抽取30只家兔采集抗凝和不抗凝血液檢測(cè)正常參考值。每只家兔均于背部剪毛直徑30 mm 大小，并于背部剪毛處皮下注射 9×109個(gè)/ml 金葡菌菌液 2 ml，每天觀察家兔體溫與局部反應(yīng)，注射金黃色葡萄球菌10 d 后所有家兔膿腫形成。每組隨機(jī)無菌抽取2只家兔膿汁標(biāo)本0.2 ml 接種血平板、革蘭染色、細(xì)菌生化鑒定。隨后每天兩次耳緣靜脈注射治療，第1組為陰性對(duì)照組，注射無菌生理鹽水0.5 ml；第2組為陽(yáng)性對(duì)照組，注射 8×105U/ml 青霉素 0.1 ml；第3組注射100 mg/ml 蒜氨酸溶液 0.1 ml，第 4 組注射 10 mg/ml蒜氨酸溶液0.5 ml，第5組注射10 mg/ml 蒜氨酸溶液0.1 ml，第6組注射1 mg/ml 蒜氨酸溶液0.5 ml。治療后24 h、72 h、7 d 每只家兔均采集抗凝血、不抗凝血液各1支。抗凝血立即檢測(cè)吞噬細(xì)胞吞噬百分率，未抗凝血液分離血清，-80℃保存用于檢測(cè)抗金葡菌抗體、IL-2和IL-7水平。

1.2.2 吞噬細(xì)胞吞噬百分率檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［16］制備熒光素標(biāo)記細(xì)菌，用無菌PBS 洗下金葡菌18 h斜面培養(yǎng)物，水浴煮沸10 min，4 000/rmin 離心20 min，沉淀用PBS 洗滌3次。pH9.5碳酸鹽緩沖液配成濃度為 9×109個(gè)/ml 的懸液，取該菌液 10 ml 加入二甲基亞砜配成 10 mg/ml 的 FITC 溶液 50 μl，使FITC 在菌液中的終濃度為50 μg/ml。混勻置37℃1 h，4%多聚甲醛固定 10 min，4 000/rmin 離心20 min，沉淀經(jīng) PBS 洗滌 3 次，用 PBS 配成濃度為9×109個(gè)/ml 細(xì)菌懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)菌的FITC標(biāo)記率，避光保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

吞噬百分率檢測(cè)：10 ml 溶血?jiǎng)┲每潭入x心管，加入兔抗凝血 2 ml 混勻，10 min 后 1 000/rmin 離心10 min，沉淀用 PBS 洗滌 3 次，用 0.5 ml PBS 分散細(xì)胞，加入1×109個(gè)/ml濃度的FITC標(biāo)記的金黃色葡萄球菌 0.2 ml，混勻置 37℃ 30 min，1 000/rmin 離心10 min，沉淀經(jīng) PBS 洗滌 3 次，用 400 μl PBS 分散細(xì)胞，流式檢測(cè)。

1.2.3 ELISA 法檢測(cè)IL-2、IL-7 水平 各標(biāo)準(zhǔn)孔加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液50 μl，在樣品孔中加入樣品稀釋液 40 μl 和血清樣品10 μl，在標(biāo)準(zhǔn)與樣品各孔中加入酶標(biāo)記抗體試劑100 μl，封板置37℃60 min。取出反應(yīng)板，洗滌時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔，同時(shí)進(jìn)行后續(xù)操作。倒掉孔中液體，加滿洗滌液，靜止30 s后倒掉洗滌液，如此洗板5次，拍干反應(yīng)板。各孔加入顯色液A 50 μl，顯色液B 50 μl，混勻置37℃ 避光顯色15 min。各孔加入終止液50 μl，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.4 金葡菌抗體檢測(cè)

1.2.4.1 金葡菌菌液制備 金葡菌18 h 肉湯培養(yǎng)物，接種于克氏瓶固體斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，用生理鹽水洗下菌苔，100℃水浴煮沸1 h，4 000/rmin離心20 min，沉淀用生理鹽水洗滌3 次，生理鹽水配制成1×108個(gè)/ml濃度菌液備用。

1.2.4.2 抗體檢測(cè) 小試管放試管架上一排12管，第1管生理鹽水0.9 ml，第2至12管0.5 ml生理鹽水。第1 管加入待檢血清0.1 ml，混勻后吸取0.5 ml加入第2管，第2管混勻后吸取0.5 ml加入第3 管，如此倍比稀釋至 11 管，混勻后吸取 0.5 ml 丟掉，第12管為對(duì)照。每管加入1×108個(gè)/ml金葡菌菌液0.5 ml混勻，置37℃、24 h觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 錄入數(shù)據(jù)，SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 膿汁標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果 12 個(gè)濃汁標(biāo)本劃線接種血平板，經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h均有單一的金黃色菌落，菌落周圍有透明溶血環(huán)；涂片革蘭染色鏡下為革蘭陽(yáng)性葡萄球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)、甘露醇發(fā)酵均為陽(yáng)性。

2.2 吞噬細(xì)胞吞噬百分率 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣本，以FSC-A 為橫坐標(biāo)，SSC-A 為縱坐標(biāo)，設(shè)置門R，門內(nèi)包含了98%以上的檢測(cè)顆粒，總共收集R門內(nèi)1×105個(gè)顆粒進(jìn)行分析，得到吞噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌的流式分析圖，如圖 1（A 為流式條件 R 門，B 為金葡菌經(jīng)FITC 染色標(biāo)記流式圖，標(biāo)記率為99.77%，C 為正常家兔吞噬百分率流式圖，D 為陰性對(duì)照組72 h 吞噬百分率流式圖，E 為青霉素組72 h 吞噬百分率流式圖，F(xiàn)~I分別為蒜氨酸治療3~6組治療72 h吞噬百分率流式圖）。

圖1 流式分析圖Fig.1 Flow cytometry analysis diagram

實(shí)驗(yàn)前采集正常家兔血液檢測(cè)吞噬百分率為正常參考值（81.36±3.12）%。各組吞噬細(xì)胞吞噬百分率結(jié)果見表1，經(jīng)方差分析差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。正常家兔的吞噬百分率均顯著高于各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01）。陰性對(duì)照組吞噬百分率均顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組和蒜氨酸治療組（P＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)吞噬百分率顯著升高（P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)的吞噬百分率均低于蒜氨酸治療組和正常參考值（P＜0.01），具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同濃度的蒜氨酸治療組24 h 各組間吞噬百分率比較均無顯著差異（P＞0.05）；治療48 h 第3、4 組顯著高于第5、6 組（P＜0.01）；治療7 d各組均明顯升高，與正常參考值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 吞噬細(xì)胞吞噬百分率（，%）Tab.1 Devour percent of phagocytes（，%）

表1 吞噬細(xì)胞吞噬百分率（，%）Tab.1 Devour percent of phagocytes（，%）

Note：Negative treatment group was significantly lower than the rest of the group，P＜0.01；penicillin treatment group is significantly higher than the negative treatment group，significantly lower than of alliin in treatment group，P＜0.01.

7 d 35.40±2.75 62.66±3.62 81.44±3.92 79.74±3.39 81.44±3.64 78.64±3.57 Groups Negative treatment Penicillin treatment Allicin treatment Injection dose NS，0.5 ml 800 000 U/ ml，0.1 ml 100 mg/ ml，0.1 ml 10 mg/ ml，0.5 ml 10 mg/ ml，0.1 ml 1 mg/ ml，0.5 ml 24 h 36.98±2.92 49.82±2.05 66.09±3.28 66.27±3.23 66.13±3.30 66.43±3.25 72 h 35.11±2.92 56.26±2.63 73.99±3.12 72.59±3.44 68.29±3.11 67.89±3.62

2.3 IL-2 水平 采集正常家兔檢測(cè)IL-2 參考值為32.22±22.02，IL-2 檢測(cè)結(jié)果見表 2，各組 IL-2 結(jié)果經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。正常家兔血清中IL-2 顯著低于各實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。陰性對(duì)照組與陽(yáng)性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯著低于蒜氨酸治療組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組血清中IL-2 顯著高于正常家兔參考值（P＜0.01），與陰性對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），顯著低于蒜氨酸治療組（P＜0.01）。蒜氨酸各治療組血清IL-2進(jìn)行組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），24 h IL-2 含量顯著高于 72 h 和 7 d（P＜0.01）；72 h 與 7 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；7 d 蒜氨酸各組治療均顯著高于陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和正常家兔參考值（P＜0.01）。

表2 細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果（pg/ml）Tab.2 Detection of cytokines results（pg/ml）

2.4 IL-7 水平 采集正常家兔檢測(cè)IL-7 參考值為28.28±16.57，IL-7 檢測(cè)結(jié)果見表 2，各組 IL-7 結(jié)果經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。正常值顯著低于各治療組（P＜0.01）。陰性對(duì)照組IL-7 顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組和蒜氨酸治療組（P＜0.01）。陽(yáng)性對(duì)照組顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）；顯著低于蒜氨酸治療組（P＜0.01）。蒜氨酸治療組72 h第3、4組顯著低于第5、6組（P＜0.01）；蒜氨酸各治療組7 d顯著高于陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和正常家兔參考值（P＜0.01）。

2.5 家兔抗金葡菌抗體效價(jià) 各組抗體結(jié)果經(jīng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。陰性對(duì)照組結(jié)果為26±8.4，顯著低于各治療組（P＜0.01）；陽(yáng)性對(duì)照組結(jié)果為112.73±46.71，顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.01），顯著低于蒜氨酸各組治療（P＜0.01）。蒜氨酸各組治療結(jié)果依次為1 047.27±97.357、1 047.27±97.357、1 047.27±334.229、1 047.27±334.229，蒜氨酸各治療組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

膿腫為常見感染類型之一，金葡菌是引起化膿性感染常見致病菌，本研究采用金葡菌感染家兔膿腫模型，經(jīng)過皮下注射金葡菌，家兔均有膿腫形成，膿汁標(biāo)本均培養(yǎng)、鑒定為金葡菌，成功建立家兔膿腫模型。

本研究通過金葡菌感染建立家兔膿腫模型，探討蒜氨酸對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用。在抗感染免疫中吞噬細(xì)胞是第一道防線，也是抗感染免疫的效應(yīng)細(xì)胞，發(fā)揮著積極有效的抗感染作用。IL-2 在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，也是具有代表性的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)因子之一。而IL-7 是一種多潛能的細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)中IL-7 有不可替代的作用。IL-7不僅是正常T、B 淋巴細(xì)胞分化成熟過程中的重要因子，還是多潛能干細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞的移動(dòng)因子，在機(jī)體免疫細(xì)胞應(yīng)激、成熟、釋放過程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，IL-7 還能促進(jìn)T 細(xì)胞功能、誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子。抗體是免疫細(xì)胞分泌的效應(yīng)因子，可顯示蒜氨酸對(duì)患病機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)效果［17-20］。因此，本研究通過檢測(cè)金葡菌感染的家兔體內(nèi)吞噬細(xì)胞的吞噬百分率、IL-2、IL-7 和抗金葡菌抗體，探討蒜氨酸對(duì)患感染性疾病家兔免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

正常家兔的吞噬細(xì)胞吞噬百分率顯著高于各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01），金葡菌外毒素對(duì)吞噬細(xì)胞有顯著的毒性作用［20］。陰性對(duì)照組吞噬百分率顯著低于各治療組（P＜0.01），青霉素進(jìn)入體內(nèi)殺死大量金葡菌，減少外毒素分泌，蒜氨酸能增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬和殺菌功能［14，21］，各治療組吞噬細(xì)胞吞噬功能均有一定程度恢復(fù)。青霉素組隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)吞噬百分率顯著升高（P＜0.01），表示隨著時(shí)間推移體內(nèi)金葡菌及其毒素減少和消失，吞噬細(xì)胞吞噬功能逐漸恢復(fù)。蒜氨酸治療組吞噬百分率顯著高于青霉素治療組（P＜0.01），蒜氨酸分子有不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)，具有抗氧化作用，能提高吞噬細(xì)胞抵抗金葡菌外毒素的毒性傷害［21］；同時(shí)蒜氨酸與細(xì)胞膜表面蛋白結(jié)合，改變膜表面蛋白空間結(jié)構(gòu)，阻止金葡菌外毒素與受體結(jié)合，使細(xì)胞免受金葡菌外毒素的傷害，蒜氨酸治療組的吞噬細(xì)胞得到有效保護(hù)；同時(shí)IL-7 高表達(dá)加快吞噬細(xì)胞成熟、釋放。72 h 蒜氨酸治療第3、4 組明顯高于第5、6 組，可能是因低濃度蒜氨酸殺菌效果欠佳，體內(nèi)金葡菌繼續(xù)增殖產(chǎn)生毒素，抑制了吞噬細(xì)胞的活性。經(jīng)過蒜氨酸7 d 治療，吞噬率與正常對(duì)照無顯著性差異（P＞0.05），顯示蒜氨酸具有較好恢復(fù)吞噬細(xì)胞吞噬功能的作用。

各治療組的IL-2 顯著高于正常家兔（P＜0.05），是機(jī)體被炎癥因子刺激所致［22］。實(shí)驗(yàn)組中，蒜氨酸治療組IL-2 顯著高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，表明蒜氨酸能提高IL-2 表達(dá)，提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力。蒜氨酸治療組間無顯著性差異（P＞0.05），說明本文蒜氨酸使用濃度范圍內(nèi)沒有劑量依賴關(guān)系；24 h 與72 h、7 d 比較均顯著降低（P＜0.01），隨著時(shí)間推移IL-2 較快降低；7 d 蒜氨酸治療各組均顯著高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，顯示IL-2 能維持一段時(shí)間較高水平。

正常對(duì)照組IL-7 顯著低于各實(shí)驗(yàn)組（P＜0.01），差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，是金葡菌感染所致炎癥刺激的結(jié)果，與文獻(xiàn)報(bào)道相符［23］。陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組IL-7 顯著低于蒜氨酸治療組（P＜0.01），表明蒜氨酸進(jìn)入機(jī)體可提高IL-7 表達(dá)。72 h 第5、6 組顯著高于第3、4 組，顯示高劑量蒜氨酸治療組的IL-7 高表達(dá)維持時(shí)間短，低劑量蒜氨酸治療維持時(shí)間長(zhǎng)，可能與金葡菌在機(jī)體內(nèi)增殖有關(guān)。7 d蒜氨酸治療組間均無顯著性差異（P＞0.05），顯著高于陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.01），顯示IL-7 在機(jī)體維持一段時(shí)間較高水平。

家兔抗金葡菌抗體，陰性對(duì)照組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組，一方面陰性對(duì)照組未進(jìn)行有效治療，機(jī)體極度衰竭，影響免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體較少；同時(shí)體內(nèi)還存在抗原物質(zhì)與之結(jié)合，消耗抗體所致抗體效價(jià)較低。青霉素組顯著低于蒜氨酸治療各組（P＜0.01），是蒜氨酸調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的結(jié)果，與文獻(xiàn)報(bào)道蒜氨酸小鼠灌胃提高脾細(xì)胞溶血空斑數(shù)相吻合［14］。

綜上所述，蒜氨酸進(jìn)入機(jī)體后對(duì)吞噬細(xì)胞具有保護(hù)作用，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞吞噬殺菌能力；提高IL-2、IL-7與抗體水平，加快免疫細(xì)胞的成熟釋放，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體免疫防御功能，消滅體內(nèi)的病原微生物。