桂林市首次在健康人群中檢出１株硫化氫陽性甲型副傷寒的實驗室報告

劉志冰 郭昕 蔣立立

【摘要】目的：防止漏檢硫化氫陽性甲型副傷寒菌株。方法：2019年2月在一食品從業人員肛拭標本中檢出1株甲型副傷寒沙門菌，用SC增菌液增菌，沙門菌顯色培養基分離，對菌株進行系統生化、血清學試驗，RT-PCR技術進行確認。結果：分離培養、生化特性、血清學試驗均符合甲型副傷寒沙門菌特性，硫化氫陽性。經微量生化等系統鑒定為1株硫化氫陽性的甲型副傷寒菌。結論：必須注意鑒別硫化氫陽性的甲型副傷寒菌。

【關鍵詞】甲型副傷寒菌;硫化氫陽性

基金項目：廣西桂林市科技局項目（NO.20190602-2）

【Abstract】Objective：to prevent the detection of H2S positive paratyphoid strain. Methods：1 strains of Salmonella paratyphi A were detected in a food worker's anal swab in February 2017. The bacteria were increased by SC bacteria， and the Salmonella color culture medium was separated. The biochemical and serological tests of the strains were carried out. The RT-PCR technique was used to confirm the separation and culture， the biochemical characteristics and the serological test. Salmonella paratyphi A is characteristic of hydrogen sulfide. 1 strains of Salmonella paratyphi positive were identified by microbiological system. Conclusion： we should pay attention to distinguishing paratyphoid A from H2S positive.

【Key words】paratyphoid A; hydrogen sulfide positive

?傷寒、副傷寒是《中華人民共和國傳染病防治法《 規定的乙類傳染病，傳染性強、病程長、易復發、并發 癥多、疾病負擔重，是發展中國家面臨的公共衛生問題之一。桂林市傷寒、副傷寒發病率一直在廣西名列前茅，于20世紀80年代為最高峰，之后開始逐漸下降，呈散發狀態，并穩定在一定水平。

2019年2月，桂林市疾病預防控制中心檢驗科病原微生物室從健康體檢人員肛拭子標本中分離到1株產硫化氫的A群沙門菌，經生化檢驗，血清凝集，細菌核酸測定，鑒定為甲型副傷寒，現將實驗結果報告如下：

1 材料與方法

1.1菌株來源：由桂林市疾病預防控制中心病源微生物檢驗室從食品從業人員健康體檢的肛拭標本中檢出。

1.2 材料 SC增菌液、克氏三糖鐵瓊脂，XLD培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司;沙門菌顯色培養基和沙門菌誘導培養基均購自科瑪嘉生物科技有限公司;沙門菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業有限公司和丹麥血清;ID32E生化試驗條購自上海星佰科技有限公司。BIO-CFX96熒光PCR儀，傷寒，副傷寒沙門菌檢測試劑盒購自深圳生科原生物科技有限公司，上述實驗材料均在有效期內使用。

1.3 方法 按照《從業人員預防性健康檢查沙門菌，志賀菌檢驗方法》（WS/T458-2014）進行試驗。

2 標本檢測

2.1 細菌分離 ?將健康體檢人員肛拭子標本接種至SC增菌液中，37℃培養18 h～ 24 h， 劃線分離到沙門菌顯色培養基以及XLD平板上， 37℃培養18 h～ 24 h后，在沙門菌顯色培養基上挑取表面光滑濕潤，紫紅色，中等大小的圓形菌落及XLD平板上挑取圓形邊緣整齊，紅色半透明，表面光滑濕潤，中心呈黑色或無色菌落轉種三糖鐵培養基上， 經37℃培養24 h， 三糖鐵管呈現葡萄糖產酸產氣， 乳糖不分解， 劃線上產生少量H2 S， 動力+。同時，將其轉種到血平板上，培養18 h～ 24 h。

2.2 生化鑒定 ? 挑取血平板上菌落調成0.5麥氏當量菌液， 按廠家說明書程序接種于ID32E生化試驗條上，37℃24小時培養后用全自動細菌鑒定系統進行生化鑒定，鑒定結果為甲型副傷寒， 鑒定編號為6704752， 具體結果如下：

陽性結果：賴氨酸脫羧酶， 鳥氨酸脫羧酶， 精氨酸雙水解酶， 葡萄糖產酸產氣， 檸檬酸鈉， 甘露醇， 硫化氫， 肌醇， 山梨醇， 鼠李糖，阿拉伯糖， 蜜二糖， 硝酸鹽還原。

陰性結果：氧化酶， ONPG， 尿素， 色氨酸脫氨酶， 吲哚， VP，明膠， 蔗糖， 苦杏仁苷。

2.3 血清學試驗： 待測菌與沙門菌屬診斷血清凝集 A - S群O 多價呈強凝集（ ++++）， 并與O2呈強凝集（+ ++ +）與 O1呈強凝集（+ ++ +）與O12呈強凝集（+ ++ +），與HMA （a， b， c， d， i， z10， z29） 呈強凝集（+ ++ +），與H a呈強凝集（+ ++ +）.H 因子第二相與診斷血清不凝集。用H a誘導血清經2次位相誘導后， 仍然不凝集。說明H 因子第二相缺失。從而得出其分子型為：2，12：a：- 。根據《沙門氏菌屬血清型診斷》中的診斷，符合甲型副傷寒沙門菌定義。

2. 4 ? 核酸鑒定：為了確保準確無誤，我們用熒光PCR法進行了甲型副傷寒核酸測定，結果為擴增曲線陽性，CT值為17.74和18.18。

2.4.1核酸提取：在已純化的營養斜面上挑取適量菌苔加入1毫升無菌生理鹽水中，混勻。取200微升加入到核酸提取試劑板中，放至核酸自動提取儀上，按操作說明進行核酸提取。

2.4.2 實時熒光PCR檢測 ? 按照生科原甲型副傷寒檢測試劑盒上說明設置反應體系，其中反應條件：95℃ 5 min;95℃ 10 s，55℃ 32 s，72℃ 15 s（共40個循環）。在第2個循環周期的55℃ 退火階段采集FAM通道的熒光數據。設無菌水作為陰性對照。 結果待檢樣本在熒光通道上與甲型副傷寒沙門菌陽性對照均出現陽性擴增曲線，CT值為17.74和18.18，陽性陽性對照CT值為19.74。

3 結論

根據上述培養特性、生化反應、血清學試驗以及核酸測定， 該分離菌符合甲型副傷寒沙門菌定義， 因此該從業人員確定為甲型副傷寒沙門菌帶菌者。

4 討論

4.1 甲型副傷寒是一種常見腸道傳染病，可以通過飲水、食物和日常生活接觸等方式傳播。桂林市地處喀斯特地貌，地下水源豐富，極易引起腸道傳染病的發生。近年來隨著國家經濟的提升，作為國家旅游勝地的桂林市人員流動急劇增加，傷寒副傷寒以及非傷寒沙門菌病例報告呈上升趨勢。

4.2 ?非傷寒沙門菌在桂林市健康人群的檢出率在0.6%--2.5%，但傷寒副傷寒在健康人群中的檢出卻很低，這可能與傷寒副傷寒為胞內寄生菌，通常入血，隨血液擴散到全身，用病人的血液做血培養檢測甲型副傷寒沙門菌比較容易檢出，但癥狀消失后常寄身在膽囊中，用肛拭子檢測難以檢測到有關。而在健康人群的肛拭子中檢出甲型副傷寒，實屬少見，產H2S株就更為罕見，故具有重大意義。

4.3 甲型副傷寒沙門菌在通常情況下不產H2S，實驗室工作人員在做產H2S菌株診斷血清凝集時容易忽略O2的凝集.當其他O因子血清都不凝時，容易被當作雜菌而被棄掉。

4.4 ?由于沙門菌顯色培養基成本比較高，基層實驗室多選擇使用XLD培養基或SS培養基。大多數沙門菌在XLD平板或SS平板上均產H2S而使菌落呈現黑色，在挑取可疑菌落時容易被發現。而甲型副傷寒沙門菌由于不產H2 S而在XLD平板上呈紅色半透明菌落，或者在SS平板上呈無色透明菌落，與大腸菌相似，及難分辨。同時在健康體檢人群的肛拭標本中，可疑菌落少，雜菌菌落復雜，在XLD培養基或SS平板上挑取可疑菌落時不容易被發現而造成漏檢。

因此提醒從事微生物檢測的工作人員，在具體檢驗過程中，要本著實事求是的態度，在遵循一般規律的同時，要考慮特殊菌株的生化特異性，多參考國內外最新資料，不能機械地、一味地按程序檢驗，注重平時經驗和規律的積累，否則易導致漏檢或誤判。

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作者簡介：劉志冰（1966-），女，廣西富川縣人，主管檢驗技師，主要從事病原微生物檢驗工作.