PACT的抗菌作用及其機制的研究進展

喬宏偉，房 巖(綜述)，方子源，趙占娟(審校)

(1.河北大學臨床醫學院臨床醫學專業，河北 保定 071002；2.河北大學基礎醫學院醫用物理學教研室，河北 保定 071002)

世界衛生組織統計表明，2017年全球由醫院獲得性感染(hospital acquired infection,HAI)造成的死亡人數約100萬人，每100例住院患者中，就有7例發達國家患者和10例發展中國家患者獲得HAI。耐藥菌是HAI中常見的感染菌，一些耐藥突變菌株如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和艱難梭菌變異迅速，通過醫院設施和個人護理用品快速傳播，感染形勢嚴峻，對人類生命健康產生威脅。因此，開發不易產生耐藥性的新型抗菌方法和抗菌藥物已成為一個重要研究方向。光動力抗菌化學療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)作為最具前景的一種新型抗菌方法，具有高選擇性、廣譜抗菌性、不良反應低以及對病原微生物不易引起耐藥等優點?，F將重點討論PACT的抗菌機制及新型光敏劑的研究進展。

1 PACT概述

20世紀初，Raab發現在陽光和光敏染料吖啶紅的作用下，微生物草履蟲會被殺死，并推測該現象是陽光將能量傳遞給化學物質的作用結果，隨后Tappeiner發現光誘發強烈的敏化反應時必須有分子氧的存在，并把有分子氧參與的這種光敏化反應稱為光動力作用(photodynamic therapy,PDT)。隨著研究的深入，人們發現PDT的作用效果與光敏劑的理化性質密切相關，如果設計出一種能夠只與微生物細胞選擇性結合的新型光敏劑，光動力就可以實現抗菌作用，即PACT作用。Jodlbauer和Huber分別在1904年和1905年成功描述光動力滅活細菌。但早期PDT多用于治療癌癥，即全身靜脈注射或局部使用光敏劑，避光一段時間后，再行激光照射殺滅腫瘤細胞。用于治療細菌性疾病的抗生素是在20世紀中葉發現的，但在1940年發現青霉素不久，便出現許多治療失敗的案例并分離出一些對青霉素不再敏感的細菌菌株，這標志著抗生素耐藥性時代的開始。如果不采取任何措施阻止多重耐藥細菌的增長，預計到2050年將有3億人過早死亡，將使世界經濟損失100萬億美元[1]。

PACT對耐藥微生物有很好的殺滅作用，迄今為止，尚未有明顯的證據表明PACT會在微生物中產生耐藥性，Giuliani等[2]發現即使經過20次連續的局部殺傷，PACT仍能發揮很好的作用。PACT的另一個優點是光敏劑可局部應用于感染區域。許多慢性感染具有生物膜狀態細菌的聚積現象，抗生素不易滲透到生物膜中，而PACT卻能殺死生物膜狀態的細胞。因此，PACT作為一種無耐藥性、毒副作用小、作用效果顯著的潛在臨床抗微生物療法得到國際社會的廣泛關注。

2 光敏劑的研究進展

由于PACT的作用效果與光敏劑(photosensitizer，PS)的理化性質密切相關，因此開發光毒性低、代謝時間短、活性氧物種(reactiveoxygenspecies,ROS)量子產率高、具有明顯陽離子電荷的PS成為學者的研究熱點之一。納米尺度的光敏劑與普通光敏劑相比，不但水溶性好，而且還可以產生更多的ROS，進而具有良好的滅菌效果?，F總結近幾年有關新型光敏劑研究的最新進展。

2.1富勒烯及其衍生物 富勒烯是一種封閉的足球狀碳同素異形體，富勒烯具有高度共軛的雙鍵，對可見光有很好的吸收，具有較高的三重態量子產率，但它們的聚集傾向和高度疏水性，使得其作為藥物在生物醫學中的應用前景不大，所以改善富勒烯的水溶性研究很有意義。目前為克服富勒烯的這些缺點，已經有許多用于富勒烯增溶和藥物遞送的方法，包括樹狀聚合物，膠束，PEG化等。Tegos等[3]設計三種聚陽離子富勒烯衍生物和三種聚陰離子富勒烯衍生物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌進行滅活，其中三種聚陽離子富勒烯衍生物顯示出極強的PACT作用，無論施加何種光，金黃色葡萄球菌的殺滅率均高達99.999 9%。體外實驗及體內局部感染動物實驗證明聚陽離子富勒烯衍生物具有高效抗菌特性。Yu等[4]將富勒烯衍生物的聚陽離子與熒光素以共價鍵聯合，由于改變了其分子結構，增加了溶水性的氨基，從而提高了在水中的溶解度，并且證明了靜電荷對水溶液中富勒烯-熒光素結構的構象及其光物理性質和光化學活性的重大影響。聚陽離子富勒烯衍生物-熒光素共軛物由于從熒光素到富勒烯的能量(電子)的轉移表現出強烈的熒光猝滅效應，使其活化產生的活性氧效率是單個熒光素或未修飾富勒烯的15倍以上。改良后的富勒烯作為新型抗菌光敏劑具有很強的光穩定性，能夠產生高毒性的羥基自由基等，但也具有波長相對較短，不能很好地穿透組織等缺點，若將其應用于局部感染區域則會達到良好的抗菌效果。

2.2石墨烯及其衍生物 石墨烯是一種二維材料且帶隙為零，石墨烯及其衍生物的抗菌研究前景廣闊。Xia等[5]研究了等離子體Ag/AgX(X=Cl,Br,I)復合材料鏈接石墨烯薄片在可見光照射下的細菌滅活機制，研究顯示該復合材料的抗菌失活率明顯提高，其抑菌性能主要是由于消毒液中H2O2等活性氧的形成和銀離子的殺菌性能，石墨烯薄片通過提供必要的電荷分離來延遲復合速率。Khadgi等[6]報道了ZnFe2O4與Ag和rGO(還原氧化石墨烯)共修飾形成新型復合材料，在可見光照射下，大腸桿菌菌株在60 min內失活，失活率達7log以上，SEM圖像也顯示了破壞后的細菌殘骸，活性氧清除實驗確定失活過程的主要活性氧種類為H2O2。Rtimi等[7]也證明具有明顯活性的磷酸鐵聚乙烯透明薄膜額可用于細菌滅活；研究表明，在陽光照射下，透明的薄膜會變成超親水性，從而使細菌完全礦化的時間從60 min縮短到30 min。

2.3二氧化鈦及其衍生物 TiO2是一種半導體，它具有毒性小、光吸收強、成本低、化學穩定性高等優點。Ouyang等[8]制備了C70與TiO2復合材料，研究了其在可見光照射下的殺菌活性。由于羥基自由基的大量產生，使其殺滅大腸桿菌的消毒率是未修飾TiO2的2倍以上。Koli等[9]發現在可見光照射下，TiO2/MWCNT復合材料由于MWCNT的有效電荷分離，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌效果更強。Liu等[10]研究了在可見光照射下TiO2/Ag3PO4復合材料對禾谷鐮刀菌的殺菌效果。由于制備的復合材料引入了有效的電荷分離，提高了可見光的吸收性能，在照射后100 min內，真菌被有效地滅活。Rtimi等[11]研究了銅修飾TiO2-ZrO2的光催化殺菌效果。由于帶負電荷的細菌細胞壁上的磷酸根和巰基與銅(強電子供體)有很強的親和力，抗菌性能突出，使其即使在極低的銅含量下，銅修飾復合材料的失活能力也比未修飾的TiO2-ZrO2高出3倍。

2.4鉍基及其衍生物 鉍基復合材料是近幾年研究人員偶然發現的新化合物，具有明顯的窄帶隙，因此與傳統的光催化劑如TiO2和ZnO相比，其可見光吸收能力更好。Wang等[12]制備了一種新型可見光活性光催化劑單斜二異硫四氧化物，研究其殺菌活性，發現在可見光照射下120 min內，細菌被完全滅活。Adn等[13]研究了不同Er3+和Y3+摻雜量的BiVO4樣品對細菌的滅活效果，發現所有鉍樣品在紫外光和可見光照射下均表現出3log的失活。

2.5其他新型抗菌劑PS 許多實驗室嘗試引入具有更高活性的化合物，或者是天然存在的染料[14]。例如，陽離子鋅酞菁RLP068、陽離子苯丙烯酮衍生物SAPYR和卟啉Sylsens B具有較高抗菌活性；從天然產物中衍生出的高效化合物，例如：從圣約翰麥汁(St John's Wort)中衍生出的陽離子金絲桃素化合物、從維生素B2衍生出的陽離子核黃素化合物以及姜黃素(姜黃中發現的黃色香料)的陽離子衍生物SACUR-3等均具有很好的抗菌效果。

3 無機鹽增強PACT作用的研究進展

Kasimova等[15]發現在噻嗪染料中添加疊氮化鈉可增強革蘭陽性和陰性細菌的PACT作用，他認為這歸因于電子從疊氮化物陰離子轉移到PS三重態，產生疊氮基自由基，進而PACT作用得到增強。Yin等[16]發現添加疊氮化物陰離子，富勒烯衍生物介導的PACT作用同樣得到加強。疊氮離子的增強表現為通過電子轉移機制產生成疊氮基自由基。需要注意的是，理論上疊氮化物增強微生物的光殺滅作用可行，但其毒性卻阻礙了臨床應用。

Vecchio等[17]通過在體外和體內添加碘化鉀，亞甲基藍介導的PACT作用持續增強。在體內還觀察到在治療后的幾天中傷口細菌復發的較少，并推測作用機理可能是由于反應性碘物質的形成，這些碘物質的生成時間短，壽命短。Zhang等[18]發現，通過添加碘化物的增強作用也適用于由聚陽離子富勒烯衍生物介導的PACT。另外還有研究表明，吩噻嗪類染料和陽離子富勒烯都不能通過添加溴化物陰離子來增強微生物殺滅作用；然而，由UVA激發的二氧化鈦納米顆粒(大的帶隙半導體)卻可以通過添加溴化物來增強光活性抗菌，這種增強是通過次溴酸鹽中間產物的產生而增強的[19]。

4 PACT作用機制的研究進展

PACT作用于蛋白質、脂質和核酸等多個分子靶標，具有非選擇性作用。PACT的這些氧化目標主要取決于PS的各自細胞定位以及新出現的ROS的最大時限擴散長度。光敏劑的細胞定位與光敏劑的化學結構(例如分子大小、電荷、親脂性)、濃度、溶劑以及細胞壁的結構有關。例如，1O2只有3～4 ms的短壽命，所以1O2的擴散長度不超過0.3 mm，并取決于周圍的介質。目前，對于PACT的作用機制尚不完全清楚，眾說紛紜，大致可分為以下幾類。

4.1PACT破壞生物膜系統 微生物生物膜是由自產聚合物基質包圍的微生物細胞的集合，存在單物種和多物種生物膜，生物膜可附著在宿主的表面，也可不附著在宿主的表面，它們主要位于宿主組織或分泌物中。據研究表明由生物膜引起的感染約占人類所有細菌和真菌感染的80%[20]。Zarnowski等[21]發現白色念珠菌耐藥性與生物膜形成有關，Chandra等[22]推測其耐藥機制主要與藥物外排泵和細胞膜甾醇的變化有關。Luke-Marshall等[23]發現在二氫卟吩e6的介導下，PACT對浮游培養物和卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的生物膜都具有顯著的殺菌活性。Li等[24]在亞甲基藍和孟加拉玫瑰紅的介導下，通過添加碘化鉀在激光共聚焦顯微鏡下觀察PACT對糞腸球菌的殺傷作用，結果顯示以生物膜形式存在的糞腸球菌被有效清除。Pinto等[25]證明在甲苯胺藍O的介導下，PACT作用可以抑制白色念珠菌在不同發育階段產生的生物膜的生存能力，Quishida等[26]得出了相似的結論，即在姜黃素的介導下，PACT作用可以抑制白色念珠菌、光滑念珠菌和變形鏈球菌在不同發育階段產生的生物膜的生存能力。

4.2PACT破壞細胞壁結構 張子平等[27]觀察到5-氨基酮戊酸介導的PACT作用，使得白念珠菌細胞腫脹變形，細胞壁結構不完整，并推測PACT作用對白念珠菌的細胞壁結構具有一定的影響。林一勤[28]探討了在新亞甲基藍的介導下，PACT對多重耐藥鮑曼不動桿菌的殺傷作用，結果顯示新亞甲基藍的濃度越高，殺傷作用越大，用透射電子顯微鏡觀察發現細菌的細胞壁結構被明顯破壞，因此推測PACT的作用機制是通過破壞細菌的細胞壁結構，來達到滅菌的目的。任雅清等[29]推測在血啉甲醚的介導下，PACT殺滅大腸桿菌的作用機制是選擇性的攻擊細菌細胞的細胞壁，致使細胞膜損傷、脂質過氧化、細胞壁上蛋白質變性，進而達到滅菌的效果。

4.3PACT破壞細菌遺傳物質 相關研究證明PACT可以破壞細菌的DNA結構。Sudhamani等[30]發現光敏劑Co(Ⅱ)配合物介導的PACT滅活大腸桿菌的效果良好，并通過電子吸收光譜法發現Co(Ⅱ)配合物對雙鏈DNA的溝槽結合傾向，通過凝膠電泳法證明Co(Ⅱ)配合物能誘導DNA裂解。劉漢杰等[31]證明在單核釕(Ⅱ)多吡啶釕配合物介導下，PACT對大腸桿菌的滅活是配合物通過嵌入DNA雙鏈內部，造成切割降解作用，以此為基礎，配合物能夠干擾細菌的轉錄過程，抑制細菌生長。M?rtensson等[32]同樣證實了在單核釕(Ⅱ)多吡啶配合物介導下，PACT對枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的滅活是配合物與DNA結合的作用。

4.4PACT破壞細菌毒力因子 近年來一些研究表明PACT不僅能夠殺滅細菌，還能使細菌的毒力因子失活。Tubby等[33]使用665 nm的激光介導亞甲基藍，可以降低金黃色葡萄球菌的毒力，并能有效地殺滅金黃色葡萄球菌，α-溶血素和鞘磷脂酶的失活不受人血清的影響，表明PACT可能對體內的這些毒素有效。PACT還能影響兩種關鍵的細菌毒力因子——脂多糖和蛋白酶的效價。Bartolomeu等[34]研究結果表明，部分外源性毒力因子的表達受PACT的影響，產腸毒素菌株對PACT的敏感性高于非產腸毒素菌株，且存活的細菌沒有產生耐藥性；與傳統抗生素相反，PACT抑制了毒力因子的表達，有效地滅活了高毒力金黃色葡萄球菌菌株和低毒力金黃色葡萄球菌菌株，也滅活了對抗生素敏感和耐藥的金黃色葡萄球菌菌株，并且在至少10個連續治療周期后不產生耐藥性，因此，這種療法可能成為一種很有前途的來控制病原微生物的抗生素替代品。

5 展 望

綜上所述，盡管PACT滅菌尚未在臨床上推廣應用，但大量體外研究顯示，與抗生素相比PACT在抗菌方面有著明顯的優點，即選擇性高，殺菌范圍廣，毒副作用小，極少誘導耐藥性等。隨著對PACT的進一步研究，PACT面臨的技術問題必將得到解決，相信在不久的將來，PACT將應用于臨床，成為消滅細菌感染的主要方法。