妊娠期糖尿病對C57BL/6J 子代成年鼠神經精神功能的影響

吳俠霏，方 婕，漆洪波，2，余昕烊

1.重慶醫科大學附屬第一醫院婦產科，重慶 400016；2.重慶市婦幼保健院，重慶 400010

妊娠期糖尿?。╣estational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠期發現的不同程度的糖代謝異常。目前，我國GDM 的發病率已達17.5%～18.9%，已然成為妊娠期最常見的合并癥之一［1］。宮內高糖環境致胎兒高胰島素血癥、組織慢性缺氧以及氧化應激等風險增加［2-3］。健康與疾病發育起源（development origins of health and disease，DOHaD）學說指出：在生長和發育的關鍵時期經歷不利因素可能對后代健康產生影響，這些影響不僅發生在兒童發育的早期階段，還可能潛伏多年，在成年期表現出來［4］。GDM子代在孕期暴露于高糖環境，遠期代謝性并發癥以及神經精神發育障礙等疾病的易感性顯著上升［5-6］。

既往研究證實，GDM子代易發生行為及精神障礙的相關疾病，主要表現為認知、記憶、語言等能力的下降， 注意力缺陷多動障礙（attention-deficit/hyperactivity disorder，ADHD）、孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）、抑郁癥等發病率較正常人群增加［5-8］。許多學者對子代ASD 及ADHD疾病展開了病理機制的探討，認為在發育的關鍵時期，母體高血糖通過促進子代海馬中晚期糖基化終末產物（advanced glycation end products，AGEs）及其受體的形成而引起炎癥，解除了對凋亡水平的調控，從而影響海馬神經的發生，降低細胞增殖和存活率［9］。海馬在聯想學習和記憶中發揮著至關重要的作用，已有確切證據表明海馬結構異常與抑郁癥以及焦慮癥等精神障礙疾病顯著相關［10-12］。但是對于孕期高血糖是否增加子代抑郁及焦慮等精神功能障礙的風險，尚需要進一步探討。本研究擬通過GDM模型小鼠探究宮內高糖環境對子代成年期行為及神經精神功能的影響，并初步分析海馬神經元發生在該疾病模型中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡、體質量18～22 g 的C57BL/6J 雌性小鼠購自重慶醫科大學動物中心。在實驗開始前均適應性飼養1 周。小鼠飼養于獨立通氣籠盒（IVC）系統的動物房，自由飲水和標準飲食。動物房溫度22 ℃～24 ℃，濕度40%～60%，光照12 h。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：AIN-93G標準飼料（LFD）、D12451高脂飼料（HFD，美國Research Diets 公司），維持飼料（NFD，北京華阜康生物科技股份有限公司），D-葡萄糖（美國Sigma 公司），人胰島素（Novolin R，40 U/mL，丹麥Novo Nordisk公司），SYBR-Green（美國Med Chem Expresss公司），4%多聚甲醛固定液（北京索萊寶公司）。

儀器： 血糖試紙及血糖儀（英國Nova Biomedical 公司），PCR 儀（美國Thermo 公司），曠場實驗箱、高架十字迷宮、高架零迷宮、懸尾實驗箱、強迫游泳儀器（美國ANY-MAZE公司）。

1.3 妊娠期糖尿病小鼠模型的建立

8 周齡C57 雌性小鼠共12 只，隨機分為GDM 組和對照組，分別予以HFD 和LFD 飲食，單獨飼養1周后，將雌性小鼠和雄性C57 小鼠進行合籠（按照1∶1 比例），次日晨8:00 檢查雌性小鼠陰道栓，將檢查到陰道栓（即受孕成功）的雌鼠分籠單獨喂養（記為E0.5d），其后均給予相應飼料。孕鼠自然妊娠至分娩，待F1小鼠出生時，記錄窩產仔數及出生體質量。子代鼠給予正常維持飲食喂養至18 周，進行行為學實驗，實驗結束后立即處死小鼠并收集海馬組織。

1.4 口服葡萄糖耐量實驗及胰島素耐量實驗

1.4.1 口服葡萄糖耐量實驗 孕鼠分別于E0.5d、E11.5d 及E16.5d 行口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT）。早晨8 點更換干凈飼養籠，禁食6 h，禁食期間飲水自由，下午2 點開始實驗。稱重，測空腹血糖水平，按0.1 mL/10 g 給予20%的D-葡萄糖溶液灌胃，測定灌胃后30 min、60 min、90 min、120 min的血糖值。

1.4.2 胰島素耐量實驗 胰島素耐量實驗（insulin tolerance test，ITT）檢測時間及準備工作同OGTT。實驗開始前，稱重，測空腹血糖水平，經腹腔注射0.5 U/kg 胰島素溶液，注射后15 min、30 min、60 min、120 min后測定各時間點的血糖值。

1.5 行為學實驗

1.5.1 開放曠場實驗 對飼養至18周子代鼠按其性別分組（n=12）分別進行行為學實驗，在安靜弱光照射環境進行，實驗前提前3 h將小鼠帶進實驗室適應環境。實驗開始后將小鼠從飼養籠取出后迅速放置于實驗箱中央區域，并立即離開。采用ANY-Maze公司行為學分析軟件自動記錄小鼠在箱體內活動，時長為5 min。

1.5.2 高架十字迷宮實驗 實驗開始前提前適應環境，實驗開始后將小鼠從飼養籠中取出并將其放在儀器中央區域，小鼠面向開臂。采用ANY-Maze公司軟件自動跟蹤記錄小鼠運動軌跡，時長為5 min。

1.5.3 高架零迷宮實驗 實驗開始前提前適應環境，實驗開始后將小鼠放在高架零迷宮封閉小巷中心。采用ANY-Maze 公司軟件自動跟蹤記錄小鼠運動軌跡，時長為5 min。

1.5.4 強迫游泳實驗 實驗開始前先進行適應性游泳，然后將小鼠從水桶中取出，烘干。實驗開始后，將小鼠輕輕提起放置于水面上，并迅速離開。采用ANYMaze公司軟件記錄小鼠不動時間和游泳時間，時長為5 min。實驗結束后將動物取出，烘干再放回鼠籠。

1.5.5 懸尾實驗 實驗開始前提前適應環境。實驗開始時，取長約17 cm膠帶將小鼠尾部固定至懸掛桿上，其中膠帶一端約2 cm部分連接到尾部。儀器離地高度為20 cm，放置完成后迅速安靜離開。采用ANY-Maze公司軟件記錄小鼠不動時間，時長為5 min。1.5.6 糖水偏好實驗 實驗開始前，小鼠分籠至單籠飼養，并且在籠中放置2 個飲水瓶。實驗前期讓小鼠適應環境及雙水瓶3 d，每天測量水的攝入量。實驗正式開始后，將左側飲水瓶中純凈水更換為1%蔗糖溶液，其余同適應期一樣。最后統計純凈水及蔗糖溶液攝入量并計算糖水偏好。

糖水偏好（%）=［蔗糖溶液消耗量/（蔗糖溶液消耗量+純凈水消耗量）］×100%。

1.6 海馬組織分離及病理學觀察

于行為學實驗結束后采用10%水合氯醛腹腔注射對小鼠進行麻醉，麻醉后處死。將腦組織放置在生理鹽水中，按照其解剖結構分離完整海馬組織，隨即置于4%多聚甲醛保存。

將4%多聚甲醛固定的海馬組織包埋于石蠟中。石蠟切片后分別進行蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，H-E）染色、鍍銀染色，脫水封片，在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 實時熒光定量PCR實驗

使用TRIzol提取海馬組織總RNA，并使用MCE反轉錄試劑盒，將RNA 反轉錄為cDNA。使用SYBRGreen 熒光試劑盒進行實時定量PCR （real time quantitative PCR，RT-qPCR），分別檢測海馬區域多巴胺（dopamine，DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、腦源性神經因子（brain-derived neural factor，BDNF）及cAMP 反應元件結合蛋白（cAMP response element-binding protein，CREB） 相 關 基 因 的 表 達（Drd1、Htr2α、Bdnf、Creb1）。其中引物由北京擎科生物合成（表1）。

表1 RT-qPCR引物（5′→3′）Tab 1 Primer sequence for RT-qPCR（5′→3′）

1.8 免疫熒光染色

將海馬組織石蠟切片經封閉和破膜后加入膠質纖維酸性蛋白（GFAP）兔一抗（1∶200）、神經元核抗原（NeuN）兔一抗（1∶200），置于濕盒中，4 ℃靜置過夜。第2日用PBS洗滌3次后再次封閉，隨后滴加二抗后室溫放置2 h，再次使用PBS 洗滌，結束后滴加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），最后將其吸走并洗滌3次。熒光切片放熒光顯微鏡下觀察并拍照，結果使用Image J軟件統計。

1.9 統計學方法

使用GraphPad Prism 8 軟件進行數據分析。數據以±s形式表示。多組間比較采用單因素方差分析；2 組間差異采用獨立樣本t檢驗進行分析。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高脂飲食誘導GDM模型

按照圖1A 方法建立GDM 模型，分別于E0.5d、E11.5d、E16.5d 進行OGTT 以及ITT。結果顯示：與對照組相比，HFD 組母鼠E0.5d 體質量、窩產仔數以及胎鼠出生體質量，差異均無統計學意義（圖1B～D）。HFD組E11.5d，E16.5d空腹血糖值較對照組上升，且差異具有統計學意義（P=0.015，P=0.042；圖1E）。E0.5d，HFD組小鼠OGTT各時間點（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min）血糖值、OGTT血 糖AUC 值、ITT 各 時 間 點（0 min、15 min、30 min、60 min、120 min）血糖值、ITT血糖AUC值與對照組相比差異均無統計學意義（圖1F、I）。E11.5d，HFD 組OGTT 時間點血糖水平較對照組明顯上升，AUC 值同樣具有差異，差異具有統計學意義（P=0.000；圖1G）；在予以胰島素后60 min、90 min、120 min 血糖水平較對照組上升，ITT 血糖AUC 值同樣上升，差異具有統計學意義（P=0.015；圖1J），提示HFD 組小鼠出現糖耐量異常。E16.5d，HFD 組小鼠OGTT 血糖值在30 min、60 min 上升，血糖AUC值明顯高于對照組，差異具有統計學意義（P=0.000；圖1H）；ITT 各時間點血糖水平及AUC 值較對照組上升，差異具有統計學意義（P=0.006；圖1K）。以上結果提示HFD 組小鼠在孕前及懷孕初始糖耐量正常，而在中晚孕期才開始出現糖耐量異常，表明小鼠模型與人GDM 發病特征類似，GDM 動物模型誘導成功。

圖1 高脂飲食誘導GDM模型Fig 1 High fat diet induced GDM model

2.2 GDM不導致子代成年鼠焦慮癥

分別對GDM 組及對照組18 周子代鼠進行行為學實驗。實驗通過行為學軟件監測小鼠5 min 活動區域并通過熱成像呈現，研究發現GDM 組與對照組在中心區域及周圍區域活動次數差異均無統計學意義；按照子代性別分組進行統計，發現組間差異仍無統計學意義（圖2A～C）。高架十字迷宮實驗顯示GDM 子代鼠活動力上差異不具有統計學意義（圖2D），統計小鼠開放臂活動次數結果顯示2 組差異不具有統計學意義，子代性別間差異同樣不存在統計學意義（圖2E、F）。高架零迷宮實驗同樣顯示2組無論是活動力還是開放臂活動次數的差異均不具有統計學意義（圖2G～I）。綜上，GDM不導致子代成年鼠焦慮癥。

圖2 GDM與成年子代鼠焦慮癥無關Fig 2 GDM not associated with anxiety disorders in adult offspring mice

2.3 GDM與子代成年鼠抑郁癥相關

實驗前，各組運動力差異不具有統計學意義。強迫游泳實驗結果顯示，GDM 組小鼠不動時間顯著增加，主要體現在F1雌性小鼠，2組間結果差異具有統計學意義（P=0.043，圖3A）；觀察2 組小鼠游泳時間，GDM 組小鼠游泳時間明顯減少（P=0.006），F1雄性小鼠組間差異不具有統計學意義（圖3B）。懸尾實驗同樣觀察不動時間，發現GDM 組子代鼠不動時間顯著增加（P=0.000），F1 雌雄小鼠差異均具有統計學意義（P=0.048，P=0.041；圖3C）。抑郁癥典型癥狀為快感缺失，表現為糖水偏好百分比的下降。本實驗結果顯示，GDM 組子代鼠糖水偏好百分比明顯下降（P=0.001），且差異主要體現在F1 雌性小鼠（P=0.000；圖3D）。以上行為學實驗均提示GDM 組成年子代鼠表現為抑郁傾向，且F1 雌性小鼠抑郁癥狀更為明顯。

為進一步探索GDM 與子代小鼠抑郁癥的相關性，行為學實驗后收集F1 雌性小鼠海馬組織進行抑郁癥相關基因mRNA 驗證。RT-qPCR 結果顯示GDM組Drd1（圖3E）、Htr2a（圖3F）、Bdnf（圖3G）表達量較對照組明顯下降，差異具有統計學意義（P=0.020，P=0.002，P=0.003），Creb1在GDM 組表達下降，但差異不具有統計學意義（圖3H）。該結果進一步說明GDM 與子代抑郁癥相關，且主要表現在子代雌性小鼠。

圖3 GDM與成年子代鼠抑郁癥相關Fig 3 GDM associated with depression disorders of adult offspring mice

2.4 GDM影響F1代雌性小鼠海馬神經元發生

為探究海馬在GDM 致子代雌性小鼠抑郁傾向中的影響，采用H-E 染色及鍍銀染色觀察F1 雌性小鼠海馬組織結構形態。海馬組織病理分析可見，GDM組海馬組織視野內海馬體神經細胞形態規則，排列整齊密集，胞核大而圓，呈均勻淡藍色或藍色，核仁清楚，細胞質豐富，層次及細胞線清晰，較對照組未見明顯異常（圖4A、B）。

圖4 GDM不改變子代小鼠海馬組織結構Fig 4 GDM not affecting the hippocampal structure of offspring mice

既往研究表明海馬神經元的發生參與了抑郁癥發病機制，因此，對F1 雌性小鼠海馬組織進行免疫熒光檢測神經元及星形膠質細胞。結果顯示：GDM 組子代鼠海馬區域NeuN 呈陽性免疫反應的神經元細胞數目明顯下降，與對照組差異具有統計學意義（P=0.005；圖5A、B）；GFAP 陽性的星形膠質細胞數目明顯下降，同樣差異具有統計學意義（P=0.030；圖5C、D）；提示海馬組織內神經元及星形膠質細胞數目下降。以上結果表明海馬組織神經元發生減少可能是GDM孕婦子代抑郁癥的潛在機制。

圖5 GDM影響小鼠海馬神經元發生Fig 5 GDM affecting hippocampal neurongenesis

3 討論

妊娠期血糖水平升高對孕婦及子代均有不利影響，近期表現為肩難產、子癇前期、大于孕齡兒等風險升高，遠期表現為II 型糖尿病、高血壓、肥胖等發病風險增加［13-14］。事實上，神經發生發育過程易受宮內高血糖及高胰島素的影響。據報道，孕期高血糖的子代發生中樞神經系統畸形的風險是正常孕婦的15.5 倍［15-16］。然而，人們對于GDM 對子代中樞神經系統發育以及遠期行為及精神異常的影響知之甚少。我們通過構建宮內高糖的動物模型，發現母體妊娠期出現糖尿病，其子代雌性小鼠遠期易發展為抑郁癥，且海馬神經元發生下降可能為其神經病理學機制。

受家族遺傳因素和后天環境因素的影響，母體糖尿病與人類后代神經發育和精神疾病相關性的研究具有挑戰性。動物模型可用以開展神經發育及精神疾病相關的行為學及功能學研究［17-18］。因此，高脂喂養嚙齒動物誘導GDM 模型是研究宮內高糖環境與后代神經發育潛在機制的理想模型［19-20］。既往研究利用此動物模型發現GDM 子代易表現出神經發育異常及精神障礙，主要表現在認知、記憶、語言等能力的下降以及患ASD、ADHD 的風險上升［19，21］，該結論也在人類幾項大型隊列研究中得到驗證［22-23］。母親GDM 對子代其他精神疾病的影響研究較少，有報道稱，其與子女抑郁、焦慮、精神分裂癥的風險增加有關［17，24-25］。本研究也發現子代在情緒狀態方面表現異常，其主要為抑郁傾向而非焦慮傾向。關于GDM 與后代情緒障礙方面的研究仍存在爭議，其原因可能是除宮內高糖環境影響外，其他諸如母體遺傳因素、家庭因素及社會環境因素等混雜因素也參與其中［17，26-27］。由此看來，從動物模型著手，在排除社會環境及家庭因素等混雜因素后，探討GDM 子代遠期情緒障礙更具嚴謹性，對未來臨床上展開相關性研究具有指導意義。

此外，我們結果顯示母體高糖環境下，子代雌性小鼠抑郁傾向表現突出。目前臨床尚未有該方面報道，僅有基于動物模型的相關結論。KINNEY 等［28］通過LashleyIII迷宮和抑制性回避任務實驗發現GDM子代雌性小鼠在長期學習和記憶方面能力下降。HUERTA-CERVANTES 等［29］發現GDM 大鼠模型后代表現為焦慮樣行為，且成年雄性子鼠焦慮程度較雌性低。本研究結論與HUERTA-CERVANTES 等研究存在差異，可能是由于GDM 模型上的差異，其研究使用的是鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的大鼠GDM 模型。綜上，糖尿病宮內環境可能對子代中樞神經系統發育的影響具有性別差異性。既往研究顯示GDM 可通過表觀遺傳學的方式影響子代中樞神經系統發育［30-32］，最近研究指出該影響還可能存在跨代效應［33］。因此，我們猜測表觀遺傳學機制可能為GDM 致雌性小鼠發展為抑郁癥的潛在原因。未來可以采用遺傳學中的雙生子模型考察表觀遺傳學機制所致的性別差異，這也是我們下一步需要探討的方向。

海馬是邊緣系統的重要組成部分，在學習記憶、情緒管理和內臟調控中發揮重要作用。長期以來，海馬是抑郁癥和應激反應研究的重點腦區［34］。本課題組研究發現GDM 子代雌性小鼠海馬結構未發生改變，但其神經遞質及腦源性神經因子表達顯著下調。其原因可能為GDM 的雌性后代抑郁癥僅表現為輕度的情緒障礙，并非重度抑郁癥自殺患者所表現出的海馬組織結構紊亂及體積減少等異常改變［35-37］。有趣的是，我們對雌性小鼠海馬神經元及星形膠質細胞染色時，發現其神經元發生顯著下降。其機制可能為宮內代謝環境異常影響了神經信號傳導通路、突觸可塑性，從而影響神經元和神經膠質細胞的生長、增殖、分化和凋亡，最終影響了后代神經發育。這也是本課題組將來致力探索的研究課題之一。

綜上所述，本研究表明GDM 成年子代小鼠表現為抑郁癥傾向，其中海馬可能參與其病理機制過程，其機制及意義需要進一步研究。

利益沖突聲明/Conflict of Interests

所有作者聲明不存在利益沖突。

All the authors disclose no relevant conflict of interests.

倫理批準和動物權利聲明/Ethics Approval and Animal Right

本研究涉及的所有動物實驗均已通過重慶醫科大學科學倫理委員會的審核批準（文件號2017-030-2）。所有實驗過程均遵照《實驗動物標準、守則和福利》的條例進行。

All experimental animal protocols in this study were reviewed and approved by Scientific Ethics Committee of Chongqing Medical University（Approval Letter No. 2017-030-2），and all experimental animal protocols were carried out by following the guidelines ofLaboratory Animal Standards，Code and Welfare.

作者貢獻/Authors'Contributions

吳俠霏、方婕參與了實驗設計；余昕烊、漆洪波參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意了最終稿件的提交。

The study was designed by WU Xiafei and FANG Jie.The manuscript was drafted and revised by YU Xinyang and QI Hongbo.All the authors have read the last version of paper and consented for submission.

·Received：2021-12-01

·Accepted：2022-03-16

·Published online：2022-04-28