基于TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)移性黑色素瘤lncRNA 生物信息學(xué)分析

于釗江

（安陽(yáng)師范學(xué)院，河南 安陽(yáng) 455000）

黑色素瘤是黑色素細(xì)胞異常增生引發(fā)的惡性腫瘤, 每年全世界有超過28 萬新發(fā)患者,6 萬多死亡病例[1]。黑色素瘤具有高度侵襲性,易廣泛轉(zhuǎn)移到淋巴系統(tǒng)和其他重要器官,近1/3 的患者最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性疾病[2]。然而,黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不清楚,需要進(jìn)一步的研究。

LncRNA 是一類無蛋白質(zhì)編碼潛能的生物大分子[3]。研究表明,lncRNA 廣泛參與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等[4],進(jìn)而促進(jìn)或抑制腫瘤的進(jìn)展。因此,闡明lncRNA 在黑色素瘤中的功能有望為病人的診斷、預(yù)后判定和靶向治療奠定基礎(chǔ)。本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選所需數(shù)據(jù), 篩選轉(zhuǎn)移性黑色素瘤相關(guān)lncRNA 及mRNA 基因,進(jìn)行生物信息學(xué)分析,旨在為轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)采集

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載471 例黑色素瘤樣本RNA-seq 和miRNA-seq 數(shù)據(jù)。將下載數(shù)據(jù)生成基因表達(dá)矩陣文件,分為原位黑色素瘤組(103 例)和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤組(368 例)。

1.2 差異表達(dá)mRNA、miRNA、lncRNA 數(shù)據(jù)分析

基于R 包edgeR 進(jìn)行差異分析, 得到差異表達(dá)的mRNA、miRNA、lncRNA 數(shù)據(jù)。其中,利用GENCODE 的gtf基因注釋文件定義RNAseq 中的lncRNA 基因, 利用R 提取lncRNA,生成表達(dá)矩陣。

1.3 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)構(gòu)建

miRcode 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)lncRNA 與miRNA 的相互作用。利用Targetscan、miRBD、miRwalk 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索miRNA 的靶向mRNA。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)果用Cytoscape3.8.1 軟件生成。

1.4 差異表達(dá)miRNA 靶基因功能注釋、通路分析

采用線上分析工具DAVID 與KOBAS 對(duì)lncRNA 靶向mRNA 進(jìn)行基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(KEGG)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)lncRNA

根據(jù)log2FoldChange≥2 和P<0.01 的標(biāo)準(zhǔn)過濾數(shù)據(jù),利用R對(duì)原位和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤樣本進(jìn)行分類比較,共篩選出39 個(gè)差異表達(dá)lncRNA,上調(diào)8 個(gè),下調(diào)31 個(gè)(見圖1a);31 個(gè)差異表達(dá)miRNA,上調(diào)13 個(gè),下調(diào)18 個(gè)(見圖1b);469 個(gè)差異表達(dá)mRNA,上調(diào)279 個(gè),下調(diào)190 個(gè)(見圖1c)。

2.2 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于線上平臺(tái)構(gòu)建的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 進(jìn)一步闡明差異表達(dá)的lncRNA 的作用。利用miRcode 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索差異表達(dá)的lncRNA 的靶向miRNA, 結(jié)果顯示MIR250HG,SOX21-AS1,WT1-AS,OSTN-AS1,MDS2 有明顯的lncRNA-miRNA 相互關(guān)系,獲得的160 個(gè)靶向miRNA 與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的差異miRNA進(jìn)行比對(duì), 篩選出7 個(gè)差異靶向miRNA, 分別是hsa-miR-150,hsa-miR-205,hsa-miR-129-5p,hsa-miR-141,hsa-miR-203,hsamiR-217,hsa-miR-26。利用Targetscan、miRBD、miRwalk 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索miRNA 的靶向mRNA,取交集獲得靶向mRNA,再與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的差異mRNA 進(jìn)行比對(duì), 最終獲得被差異表達(dá)的miRNA 所靶向的50 個(gè)mRNA, 其ceRNA 網(wǎng)絡(luò)使用Cytoscape3.8.1 軟件構(gòu)建,如圖2 所示。

2.3 差異表達(dá)的mRNA 功能注釋及通路分析

通過DAVID 與KOBAS 在線分析軟件對(duì)ceRNA 調(diào)控網(wǎng)中miRNA 靶向的50 個(gè)差異mRNA 進(jìn)行GO 分析和KEGG 通路分析。GO 分析發(fā)現(xiàn),生物學(xué)過程主要集中在生物調(diào)控,多細(xì)胞過程,刺激反應(yīng)過程,細(xì)胞組分在細(xì)胞膜區(qū)域富集,分子功能集中在蛋白質(zhì)結(jié)合,離子結(jié)合,核酸結(jié)合(見圖3)。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)其主要集中在Salivary secretion,cAMP signaling pathway 等通路(見表1)。

圖3 ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中差異mRNA 的GO 分析

3 討論

人類癌癥轉(zhuǎn)錄組的全基因組已經(jīng)表明,lncRNA 表達(dá)是癌癥中最普遍的轉(zhuǎn)錄變化之一[5]。LncRNA 可通過組蛋白修飾、NDA 甲基化、轉(zhuǎn)錄因子活性調(diào)控、剪切調(diào)控[6]等多種途徑來參與腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。本文通過挖掘TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù),得到MIR205HG、SOX21-AS1、WT1-AS、OSTN-AS1、MDS2 五lncRNA。研究顯示SOX21-AS1 的異常表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌和乳腺癌的增殖、侵襲、遷移[8];過表達(dá)WT1-AS 可抑制細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞遷移和侵襲[9];OSTN-AS1 是一種新的基于ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的三陰性乳腺癌免疫相關(guān)預(yù)后標(biāo)志物[10];受體樣激酶MDS2 促進(jìn)SUMM2 介導(dǎo)的免疫[11]。

ceRNA 調(diào)控網(wǎng)失調(diào)可以引起癌癥的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。通過ceRNA 調(diào)控網(wǎng)、GO、KEGG 分析發(fā)現(xiàn)lncRNA 與miRNA相互作用,進(jìn)而調(diào)控差異mRNA 的表達(dá),對(duì)信號(hào)通路產(chǎn)生影響,最終影響黑色素瘤的發(fā)生,轉(zhuǎn)移及遷徙。