miR-204-5p、miR-1233-3p 在妊娠期高血壓疾病孕婦中的表達及臨床意義

吳桂梅 李冀云 金 燕 劉紅玲 王文杰 邢曉紅 曹艷敏

河北省滄州市中心醫院產科，河北滄州 061000

妊娠期高血壓疾?。╤ypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP）是妊娠期常見合并癥，發病率為5.2%～8.2%[1]，其發病機制復雜，其中胎盤功能障礙是HDCP 的主要病因，免疫因素和全身炎癥反應等也參與其中[2]。微RNAs（micro RNAs，miRNAs）是一種調控基因表達的單鏈非編碼小分子RNA，miRNAs 調控網絡在多種病理過程中發揮著重要作用?，F有研究顯示HDCP 患者存在miRNAs 失調[3]。miR-204-5p 是已知的與惡性腫瘤相關的miRNA，在HDCP 中也出現異常表達[4]。miR-1233-3p 是一種多功能miRNA，Munaut 等[5]研究發現miR-1233-3p 在子癇前期中表達升高。本研究擬探討miR-204-5p、miR-1233-3p 與HDCP 發病和進展的關系，并分析其對HDCP 的診斷價值?，F將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年12 月至2020 年6 月河北省滄州市中心醫院（以下簡稱“我院”）收治的197 例HDCP 患者為研究對象。納入標準：①符合2018 年國際妊娠期高血壓研究學會擬定的HDCP 診斷標準[6]；②單胎妊娠。排除標準：①合并妊娠期糖尿病、腎炎、肝內膽汁淤積等其他合并癥；②雙胎妊娠；③合并自身免疫疾病、血液疾病、惡性腫瘤；④既往高血壓、糖尿病病史。根據HDCP 分類標準將其分為妊娠期高血壓組（102 例）和子癇前期組（95 例）。另隨機選擇同期于我院產科門診規律圍產期保健并入院待產的82 名正常足月單胎妊娠孕婦為對照組，排除妊娠期糖尿病、高血壓、羊水異常、胎兒發育異常等。所有受試者均知情同意并簽署知情同意書，本研究經我院醫學倫理委員會批準。

1.2 miR-204-5p、miR-1233-3p 以及炎癥因子檢測

所有受試者入院后72 h 內采集外周靜脈血6 ml，注入兩份干燥試管，一份用于檢測miR-204-5p、miR-1233-3p，另一份用于檢測白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）。取血清樣本，Trizol 法提取總RNA，選擇A260/A280為1.8～2.0 的RNA 樣品，M-MLV 逆轉錄酶（Epicentre 公司）按照說明將其轉錄為cDNA。CFX96 實時熒光PCR 儀（美國Bio-Rad）檢測miR-204-5p、miR-1233-3p表達。引物序列，miR-204-5p 正 向：5’-GCCAGATCTGGAAGAAGATGGTGGTTAGT-3’，反向：5’-GGCGAATTCACAGTTGCCTACAGTATTCA-3’；miR-1233-3p 正向：5’-ACCTCCAGCTGGCATTATTACTTTTGG-3’，反向：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。U6 snRNA 正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。PCR 反應體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ（2×）12.5 μl，dNTP 1.6 μl，Taq DNA 聚合酶1 μl，正反向引物10 μmol/L 各1 μl，加反應緩沖液至25 μl。反應條件：95℃變性10 s，65℃退火20 s，75℃延伸15 s，共40 個循環。以U6 snRNA 為內參，2-ΔΔCt計算miR-204-5p、miR-1233-3p在各組的相對表達量。采用酶聯免疫吸附試驗法檢測血清IL-6、TNF-α 水平，試劑盒購于北京奧維亞生物技術有限公司（批號：181025、180924）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson 相關系數，診斷效能分析采用ROC 曲線。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組一般資料比較

三組年齡比較，差異無統計學意義（P >0.05）。子癇前期組、妊娠期高血壓組分娩孕齡、新生兒體重小于對照組，收縮壓、舒張壓高于對照組（P <0.05）。子癇前期組24 h 尿蛋白定量高于對照組、妊娠期高血壓組（P <0.05）。子癇前期組分娩孕齡、新生兒體重小于妊娠期高血壓組（P <0.05），收縮壓、舒張壓高于妊娠期高血壓組（P <0.05）。見表1。

表1 三組一般資料比較（）

表1 三組一般資料比較（）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與妊娠期高血壓組比較，bP ＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 三組血清miR-204-5p、miR-1233-3p表達及IL-6、TNF-α 水平比較

子癇前期組、妊娠期高血壓組血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表達及IL-6、TNF-α 水平高于對照組（P<0.05）；子癇前期組血清miR-204-5p、miR-1233-3p表達及IL-6、TNF-α 水平高于妊娠期高血壓組（P <0.05）。見表2。

表2 三組血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表達及IL-6、TNF-α 水平比較（）

表2 三組血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表達及IL-6、TNF-α 水平比較（）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與妊娠期高血壓組比較，bP ＜0.05。IL-6：白細胞介素-6；TNF-α：腫瘤壞死因子-α

2.3 miR-204-5p、miR-1233-3p 表達與臨床參數及IL-6、TNF-α 的相關性分析

HDCP 患者miR-204-5p、miR-1233-3p 表達與分娩孕齡、新生兒體重呈負相關（rmiR-204-5p=-0.403、-0.395，rmiR-1233-3p=-0.321、-0.354，P ＜0.05）；與收縮壓、舒張壓、24 h 尿蛋白定量、IL-6、TNF-α 呈正相關（rmiR-204-5p=0.653、0.619、0.597、0.594、0.601，rmiR-1233-3p=0.624、0.609、0.543、0.615、0.631，P ＜0.05）；與年齡無關（rmiR-204-5p=0.165，rmiR-1233-3p=0.128，P ＞0.05）。

2.4 miR-204-5p、miR-1233-3p 診斷HDCP 的效能分析

miR-204-5p、miR-1233-3p 診斷HDCP 的最佳截斷值分別為1.65、1.52，曲線下面積（area under the curve，AUC）值分別為0.607、0.621；miR-204-5p、miR-1233-3p 聯合診斷HDCP 的AUC 值為0.881，大于miR-204-5p、miR-1233-3p 單獨檢測的AUC 值（Z=3.056、2.613，P ＜0.05）。見圖1、表3。

表3 miR-204-5p、miR-1233-3p 診斷HDCP 的效能分析

圖1 miR-204-5p、miR-1233-3p 診斷HDCP 的ROC 曲線

3 討論

HDCP 以全身小血管痙攣，胎盤供血減少，滋養細胞侵襲不足為主要病理生理特征，可導致胎兒宮內發育遲緩、早產或死亡，母體臟器功能衰竭、休克甚至死亡[7-8]。目前HDCP 診斷多依靠臨床表現、體征、血壓/尿蛋白監測等，當發現蛋白尿時已經處于子癇前期，尋找可靠、有效的生物標志物已成為圍產醫學研究的熱點。miRNA 具有翻譯、調控基因表達功能，調控細胞增殖、分化和凋亡[9-10]，對于維持胎盤穩態和功能有重要意義[11-12]，有望成為HDCP 診斷的標志物。

miR-204-5p 為一種抑癌基因，在惡性腫瘤發生發展中的作用已被多數研究證實[13]，miR-204-5p 表達可抑制膠質瘤細胞生長、遷移和侵襲[14]。miR-204-5p還可調節細胞周期蛋白D1 和細胞周期蛋白A1 表達，抑制肝癌細胞增殖和克隆生成能力[15]。Rodosthenous等[16]發現妊娠中期母體血液中循環的miR-204-5p 表達與胎兒生長發育有關。動物研究顯示miR-204-5p通過靶向氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔激活因子1和沉默信息調節因子2 相關酶1 mRNA3’ 非翻譯區，抑制其表達，損害胎兒線粒體功能，影響胎兒發育[17]?？梢妋iR-204-5p 可能調控妊娠期間某些生理和病理過程。本研究結果顯示，miR-204-5p 在HDCP 表達升高。miR-204-5p 參與HDCP 發病機制可能為：①miR-204-5p 可能通過促使人絨毛膜細胞凋亡，導致滋養細胞侵襲不足，誘發HDCP。體外研究顯示，抑制miR-204-5p 表達可促進人絨毛膜細胞增殖，減少細胞凋亡[4]。②miR-204-5p 通過下調基質金屬蛋白酶9表達，降低滋養細胞增殖和侵襲能力[18]，導致HDCP。③炎癥反應與HDCP 發病密切相關，miR-204-5p 過表達可通過抑制組蛋白去乙?；? 表達促使炎癥細胞因子產生，增加細胞凋亡[19]。本研究結果顯示，miR-204-5p 與IL-6、TNF-α 水平呈正相關，提示miR-204-5p 可能通過炎癥反應參與HDCP 發病。

miR-1233-3p 是一種多功能miRNA，參與細胞內周期調控，在DNA 復制增殖中起關鍵作用[20-21]?，F有報道顯示，miR-1233-3p 表達受環狀RNA 調控參與多種惡性腫瘤的發生和進展，miR-1233-3p 是EHMT1 靶點，EHMT1/miR-1233-3p 通過調控基質金屬蛋白酶2 表達參與乳腺癌細胞遷移和侵襲[22]。miR-1233-3p 在環狀分子0007766 調控下通過靶向生長分化因子15 調控胃癌進展[23]。miR-1233-3p 在HDCP的報道并不多見，本研究結果顯示，miR-1233-3p 在HDCP 中表達升高。miR-1233-3p 參與HDCP 發病的可能機制如下：①miR-1233-3p 可介導細胞定向轉移，激活趨化因子受體表達，促使炎癥細胞產生轉移[24]，損傷血管內皮組織，導致膠原組織暴露，組織因子釋放，刺激血小板黏附聚集，激活凝血反應、高凝狀態和纖溶亢進，最終發生HDCP。本研究結果顯示，miR-1233-3p 表達與IL-6、TNF-α 水平呈正相關，說明miR-1233-3p 可能通過炎癥反應參與HDCP 發病。②cAMPPKA 信號通路可調節胎盤滋養細胞分化，miR-1233-3p 通過抑制cAMP-PKA 信號通路相關蛋白表達，參與HDCP 的發生和發展[25]。③miR-1233-3p 可靶向抑制HoxB3 表達，引起Na+峰和后除極改變，導致Ca+-鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ及依賴性蘭尼堿受體磷酸化，引起鈣鈉交換異常，影響血管平滑肌張力，導致高血壓[24]。

ROC 曲線結果顯示，miR-204-5p、miR-1233-3p對HDCP 診斷均具有一定價值，聯合檢測明顯提高了HDCP 的診斷效能。如果miR-204-5p、miR-1233-3p表達同時升高，妊娠期間罹患HDCP 的風險更大，臨床應給予重視和干預。

綜上所述，HDCP 患者血清miR-204-5p、miR-1233-3p 表達上調，miR-204-5p、miR-1233-3p 表達與分娩孕齡、新生兒體重均有關。miR-204-5p、miR-1233-3p 可能通過上調炎癥反應參與HDCP 發病過程，聯合miR-204-5p、miR-1233-3p 對HDCP 診斷具有較高應用價值。