基于網絡藥理學和分子對接探討杜仲-淫羊藿-骨碎補組方治療骨質疏松癥的作用機制

吳 鵬 李 莎 時孝晴 廖太陽 陳巨鵬

南京中醫藥大學附屬醫院骨傷科，江蘇南京 210029

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是一種骨量低下、骨微結構受到損壞，脆性增加的全身性疾病[1]。目前，西醫對OP 的治療主要以促進骨形成和抑制骨吸收為主，大多藥物治療較為局限，具有一定副作用，而且價格較為昂貴[2]。中醫藥治療OP 效果確切、患者依從性較好，在OP 的治療中占據十分重要的位置[3]。杜仲-淫羊藿-骨碎補（eucommia ulmoides-epimediumrhizoma drynariae，DYG）一直都是中醫藥治療OP 的核心藥物，也是南京中醫藥大學附屬醫院經典名方—補腎活血健骨方的主要組成成分[4-5]，但其治療OP 的主要成分及作用機制尚不明確。

網絡藥理學能夠通過分析“藥物-基因-蛋白”的相互作用網絡，系統地揭示藥物與疾病的相關性[6-7]。本研究基于網絡藥理學和分子對接，探討DYG 治療OP 的潛在機制，為其治療OP 提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 篩選DYG 活性成分與作用靶點

通過檢索中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）獲取杜仲、淫羊藿、骨碎補的活性成分，根據成分藥物代謝動力學吸收、分布、代謝、排泄參數進行篩選，條件設置如下：藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18，聯合Perl 語言與Uniprot 數 據 庫（https：//www.uniprot.org/uniprot/）篩 選出DYG 的相關靶點[8]。

1.2 OP 靶點查詢與篩選

以“Osteoporosis”為關鍵 詞 在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets 和DrugBank 數據庫檢索與OP 相關的基因。將藥物活性成分與疾病相關的靶點進行映射，篩選出共同靶點，繪制維恩圖。

1.3 構建DYG 與OP 作用靶點網絡

將篩選得到的DYG 活性成分和OP 相關靶點篩選結果導入Cytoscape 軟件構建DYG 活性成分與OP靶點網絡。使用Cytoscape 軟件NetworkAnalyzer 工具計算網絡相關屬性。

1.4 構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein protein interaction，PPI）及篩選核心靶點

將藥物-疾病共同靶點導入STRING 數據庫（https：//string-db.org/），設置物種：Homo sapiens，置信度：0.4，保存PPI 圖。將PPI 數據導入Cytoscape 軟件，借助CytoNCA 插件，根據度中心性（degree centrality，DC）、介數中心度（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心度（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity，LAC）、網絡中心性（network centrality，NC）等參數進行拓撲分析。將上述參數的拓撲分析結果取兩次中間值，最終獲得的節點為核心靶點。

1.5 GO 功能富集分析和KEGG 信號通路分析

GO 功能富集分析用來對DYG 治療OP 的分子功 能（molecular function，MF）、生物 過 程（biological process，BP）和細 胞成 分（cellular components，CC）進行注釋。KEGG 信號通路分析用來預測DYG 治療OP的相關通路，選擇富集程度最高的前20 項。

1.6 分子對接

使用Discovery Studio 2016 進行分子對接。DYG類藥成分與OP 作用靶點分別通過Chemical Book 數據庫和PCSB PDB 數據庫獲取。將上述獲得的靶蛋白進行去水、加氫等處理，保存為對接受體。使用Lib-Dock 模塊進行分子對接。LibDock score 評價活性成分和關鍵靶點之間的對接效應，分數越高提示配體與受體蛋白結合性越好。

2 結果

2.1 DYG 活性成分

通過檢索TCMSP 數據庫，設置OB 和DL 等參數初步篩選到生物活性成分75 個，刪除重復及無效活性成分，最終得到38 個有效活性成分。

2.2 構建DYG 活性成分與OP 作用靶點

檢索TCMSP 數據庫中成分靶點，刪除無效與重復的靶點，最終得到168 個活性成分作用靶標，在GeneCard、OMIM、PharmGkb、Therapeutic Targets 和Drug Bank 數據庫中檢索到4547 個與OP 相關靶點，映射后得到121 個共同靶基因。見圖1。

圖1 DYG 成分與OP 靶點維恩圖

2.3 構建DYG 活性成分與OP 靶點網絡

將38 種活性成分與121 個OP 相關作用靶點進行映射后導入Cytoscape 構建DYG 成分-OP 靶點網絡，見圖2。使用NetworkAnalyzer 工具對網絡圖進行統計，得出各節點的degree 值。結果顯示，活性成分中kaempferol（degree=124）的連接度靠前。

圖2 DYG 成分OP 靶點網絡

2.4 核心靶點篩選

將121 個關鍵靶標導入STRING 數據庫，PPI 網絡顯示其中162 個節點，638 條邊，見圖3。將TSV 數據導入Cytoscape，基于DC、BC、CC、EC、LAC、NC，使用CytoNCA 對上述數據進行分析。最終得到IL-1β、MMP9、MAPK8、CXCL8、VEGFA、PTGS2、JUN、IL-6、MAPK1、EGF、AKT1 為核心靶點，見圖4。

圖3 DYG 靶點PPI 網絡

圖4 DYG 治療OP 潛在核心靶點

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路分析

GO 富集分析顯示生物過程主要涉及磷酸酶結合、酰胺結合、核受體活動等，見圖5。KEGG 通路分析顯示潛在信號通路主要包括AGE-RAGE、細胞凋亡、IL-17、TNF 等信號通路，見圖6。

圖5 DYG 活性成分潛在治療OP 靶點的GO 功能分析

2.6 分子對接分析

本研究對核心靶點與所有活性成分都進行了分子對接，由于kaempferol 的degree 值最高，所以進行了代表性展示。結果顯示DYG 活性成分kaempferol與IL -6、EGF、JUN、MAPK8、CXCL8、MMP9、MAPK1、IL-1β 均能較好對接。對接過程見圖7，配對結果見表1。

表1 kaempferol 與OP 靶受體蛋白分子對接情況

圖7 DYG 活性成分kaempferol 和OP 核心靶點對接過程

3 討論

OP 屬于中醫“骨痿”“骨枯”范疇。《素問·痿論篇》中：“腎主身之骨髓……腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿。”《諸病源候論·卷三·虛勞病諸候》記載：“肝主筋而藏血，腎主骨而生髓。虛勞損血耗髓，故傷筋骨也。”表明大多醫家認為OP 的發生多與脾腎虧虛、肝郁氣滯血瘀密切相關，“虛”為本，瘀為“標”[9-10]。

杜仲、淫羊藿和骨碎補已被廣泛運用于OP 的治療。馬定耀等[11]研究結果顯示，骨碎補、淫羊藿配伍杜仲能顯著提高OP 患者的骨密度，緩解疼痛。賴滿香等[12]基于中醫傳承輔助系統對治療原發性OP 的相關方劑組方規律進行了相關分析，結果顯示淫羊藿、杜仲、補骨脂組合在相關治療OP 的方劑中使用達16 次，杜仲、淫羊藿和骨碎補在相關處方中使用頻數分別達到52、46、41 次。趙亮等[13]研究結果顯示，給予去卵巢OP 大鼠6 g/kg 鹽灸杜仲能夠促進成骨細胞分化，抑制骨吸收。朱貴忱等[14]發現淫羊藿聯合鈣爾奇D 較單獨口服鈣爾奇D 更能顯著縮短OP 患者腰背部疼痛時間，增加骨密度。李展春等[15]發現骨碎補能夠改善OP 大鼠骨微結構，提高生物力學性能。

本研究篩選出了DYG 的38 個活性成分，其中骨碎補的有效成分柚皮素能夠上調Bcl-2 表達、下調Bax、Caspase-3 表達抑制成骨細胞凋亡[16]。骨碎補總黃酮能夠促進大鼠成骨細胞內VEGF 和成纖維細胞生長因子2（FGF-2）的表達，促進血管新生，有助于成骨細胞的增殖和分化[17]。淫羊藿苷能夠激活成骨細胞內cAMP-PKA 信號通路，顯著增加堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原和Runx-2 的表達促進成骨細胞的增殖[18-19]。杜仲總苷能顯著提升去睪丸大鼠骨密度和ALP 的濃度[20]。杜仲乙醇提取物能夠促進成骨細胞增殖，間接抑制破骨細胞分化[21]。在11 個防治OP 的作用靶點中有8 個相關蛋白最終成功分子對接。IL-1β 能夠調節骨重吸收，刺激成骨細胞產生IL-6 和TNF，相互協調共同促進骨吸收。IL-6 能夠誘導破骨細胞活化，增加活性，抑制凋亡，延長壽命。EGF 可以作用于骨吸收和骨形成，能夠激活破骨細胞，抑制其相關功能[22]。MMP9 與破骨細胞分解骨基質有機成分能力密切相關，是破骨細胞骨吸收的重要標志物[23]。MAPK8 能夠調節細胞的分化、增殖和存亡。MAPK1 可以通過促進成骨細胞的增殖，增加成骨能力。CXCL8 和JNK 均能加劇炎癥反應[24-26]。

本研究基于網絡藥理學和分子對接對DYG 治療OP 的作用機制進行了相關分析，通過GO 功能富集分析和KEGG 通路分析，初步推測DYG 可能通過相關有效活性成分調控IL-6、EGF、JUN、MAPK8、CXCL8、MMP9、MAPK1、IL-1β 等靶點調節AGE-RAGE、細胞凋亡、IL-17、TNF 等信號通路，抑制破骨細胞的生成，刺激成骨細胞生長，調節骨代謝平衡，抑制相關炎癥因子。本研究初步闡釋了DYG 多靶點，多通路治療OP，為DYG 治療OP 提供了科學依據和新的方向。