替莫唑胺治療腦膠質瘤患者HOXB9基因、多重耐藥相關分子的表達與相關性

張淑芳

（福建省南平市第一醫院放療科，福建 南平 353000）

膠質瘤生長迅速，具有較強的侵襲性，手術治療組織難度系數大，徹底清除病灶，許多藥物難以進入血腦屏障，化療藥物長期使用后會出現耐藥性，因此，即使是手術結合放療和化療的患者，也同時需要有效的治療基礎來提高化療的整體治療效果[1-2]。治療腦膠質瘤的有效藥物包括替莫唑胺，但患者可能因耐藥性原因造成治療效果低下。以往的研究表明，替莫唑胺的耐藥與多藥耐藥蛋白有著緊密的聯系。多藥耐藥主要表現為多藥耐藥相關分子的異常表達，如P-GP、MGMT、DNA錯配修復（MMR）系統等[3-4]。hMLH和hMSH2基因是否穩定直接影響細胞的修復功能，而HOXB9在乳腺癌、肺癌等多種疾病中表達不同。在促進腫瘤發展以及凋亡中起重要作用[5-6]。因此，研究HOXB9基因在腦膠質瘤患者替莫唑胺化療中的表達是否具有合成代謝作用，以及HOXB9基因的表達與替莫唑胺化療耐藥之間是否存在一定的相關性，具有重要的臨床意義[7-8]。研究選取我院在2016年7月至2021年7月80例患者，觀察腦膠質瘤化療患者HOXB9基因表達與多藥耐藥相關分子及上述指標的關系。現將具體內容報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院在2016年7月至2021年7月所接收治療經過化療的腦膠質瘤患者共80例，按照患者是否對替莫唑胺產生耐藥性分別分為耐藥組及非耐藥組，兩組各40例。耐藥組中男21例，女19例，年齡在65～75歲，平均年齡（69.11±2.04）歲，非耐藥組中男20例，女20例，年齡在66～77歲，平均年齡（69.14±2.02）歲。兩組一般資料比較無明顯差異（P＞0.05）。且所有患者及家屬均知曉此次研究。此次研究經過醫院倫理會支持。納入標準：①所有患者均經過磁共振成像確診為腦膠質瘤。②所有患者術后均接受化療。③所有患者病理組織為完全封閉狀態。排除標準：①伴隨遠處轉移。②伴隨其他惡性腫瘤。③機體素質低，不能忍受化療。④其他臟器功能障礙。

1.2 方法 所有儀器以及試劑：主要使用由中國科學院上海研究所生物化學與細胞生物學研究所提供的人惡性膠質瘤u251株；并且使用由Solarbio（美國）生產胎牛血清和DMEM，噻唑藍（MTT）試劑盒選用碧鹽田生物科技有限公司，Tranawall試驗箱由康寧（美國）制造，從AB-CAM（美國）中篩選出兔抗HOXB9和抗人IgG二級抗體，PrimeScript由上海吉馬制藥技術有限公司負責完成。CDNA反轉錄試劑盒由北京康美有限公司提供，用于熒光定量PCR。ENVISIONTM兔和大鼠染色試劑盒、SYBR Premix ExtaqTM II試劑盒和抗MGMT、HMSH2與HMLH多克隆抗體分別選自上?；蚬尽⒈本┛低锛夹g有限公司、武漢寶西。樣品處理方法：所有樣品固定、脫水、切片、包埋、染色。以上操作嚴格按照試劑、儀器、試劑盒說明書進行，全過程由專業人員進行，嚴格質量控制。

1.3 觀察指標 ①觀察兩組患者的HOXB9基因、P-gP、MGMT、hMLH以及hMSH2的陽性率以及陰性率。其中HOXB9基因判定方法為：選擇5個視野高功率場（細胞數＞200）觀察陽性細胞的染色強度，計算陽性細胞的占比。檢測規則為：陽性染色信號為核內黃棕色顆粒，0為未染色，1為淺黃色，2為黃色，3為棕黃色；然后根據陽性細胞比例評分為0分（陽性細胞比例＜5%）、1分（≥5%和＜25%）、2分（≥25%和＜50%）、3分（≥50%和＜75%）和4分（≥75%）。相乘得最后分數，并根據最終分數計算著色程度。p-gp和mgmt檢測方法分為陽性（膠質瘤細胞膜或細胞質可見棕色顆粒10%～30%）、強陽性（陽性細胞數≥30%）和陰性（陽性細胞少于10%）。HMLH和HMSH2通過隨機抽取10個高倍視野區的400個腦膠質瘤細胞中陽性細胞的比例來測定的。陽性：腫瘤細胞可見棕黃色顆粒，陽性細胞比例≥25%；陰性：陽性細胞少于25%。在上述檢測結果中，以陽性切片為對照，5%胎牛血清替代原代抗體為陰性對照。本研究以陽性和強陽性均為陽性。②使用回歸分析HOXB9基因對于接受替莫唑胺化療的患者的耐藥性。

1.4 統計學方法 使用SPSS20.0軟件進行處理，計數資料行χ2檢驗與Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HOXB9基因與多藥耐藥相關分子的表達 經過對比兩患者的HOXB9基因與多藥耐藥相關分子的表達可知，耐藥組的HOXB9以及P-gP、MGMT的陽性率明顯高于非耐藥組（P＜0.05），hMLH以及hMSH2的陰性率明顯高于非耐藥組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者的HOXB9基因與多藥耐藥相關分子的表達比較[n（%）]

2.2 HOXB9基因對于接受替莫唑胺化療的患者的耐藥性回歸分析 經過分析HOXB9基因對于接受替莫唑胺化療的患者的耐藥性可知，以接受替莫唑胺化療的患者的耐藥性為因變量，以HOXB9基因為自變量，經Logistic回歸分析證實HOXB9可能是影響患者耐藥的影響因素（P＜0.05）。見表2。

表2 HOXB9基因對于接受替莫唑胺化療患者的耐藥性回歸分析

3 討論

膠質瘤抗性機制是復雜的、多層次的。盡管對耐藥基因及其產物進行了許多臨床研究，但在接受化療的患者中，耐藥基因與其耐藥性之間的聯系尚不清楚。研究腦膠質瘤患者的耐藥性對于降低其耐藥性和提高臨床化療效果至關重要[9-13]。研究表明，腦膠質瘤患者化療耐藥是多種因素綜合作用的結果。膠質瘤患者化療耐藥的原因主要包括：①化療對跨越屏障沒有幫助。②少量膠質瘤藥物積累。③加速許多化療藥物的解毒和代謝。④DNA損傷和修復的影響等。近年來，腦腫瘤化療的臨床研究進一步發展，HOXB9基因及多藥耐藥相關分子P-gP、MGMT、HM-LH、hMSH2等的表達產物與腦膠質瘤患者化療耐藥密切相關[14-17]。替莫唑胺含有大量咪唑嗪環，為首要化療藥物。它容易進入血腦屏障，引起細胞DNA烷基化，進而發揮毒性作用。其雖在一定程度上改善了患者預后，但療效較差，尤其對復發患者，主要原因是患者對替莫唑胺的耐藥增加。因此，探索一種有效逆轉耐藥的方法，對于提高該病患者的化療療效具有重要意義。

HOXB9基因屬于HOX家族。研究表明HOX家族成員在參與胚胎生長、干細胞自我修復和再生以及組織重建等生理過程的同時，還與許多外來生物的生長和進化密切相關。此外，它們可以編碼轉錄因子，調節它們之間的共同基因表達[18-20]。龍璐璐等[21]研究人員研究發現HOXB9基因是一種抑癌基因，HOXB9基因在甲狀腺乳頭癌的增殖中發揮著重要作用，可以成為治療的新目標。這些結果表明HOXB9基因可能為治療提供新的思路。

MGMT是DNA修復酶，可以幫助染色體避免化學物質造成的損傷，這些物質有助于治療藥物的細胞解毒。P-gP分布在細胞膜上具有分泌和分泌功能，其主要生理功能包括維持正常生理、激素和轉化以及調節細胞功能。吞咽、呼吸代謝和藥物解毒[22-24]。依賴能源的藥物出口泵不僅在抗腫瘤藥物的匯合點，而且在抗腫瘤藥物的交配點。因此一旦P-gP和抗腫瘤藥物結合起來，就可以通過ATP裝置產生能量，ATP裝置將致癌灶細胞泵出，并減少細胞中濃度改變，降低藥物作用，產生一定的耐藥性。其中hMLH和hMSH2是主要基因，對控制基因改變和保持功能的完整性十分重要。錯誤修復系統中的任何基因變化都可能導致細胞功能的喪失，使其錯誤復制或不穩定[25-27]。本研究結果提示HOXB9基因的表達可能與腦膠質瘤患者對替莫唑胺化療產生耐藥性有關。HOXB9基因的高陽性表達率可能是腦膠質瘤患者對替莫唑胺化療耐藥的一個影響因素。且該結果與Bai等[28]研究結果中HOXB9基因陽性率具有一致性。因此該病患者在應用替莫唑胺治療前，可以及時、合理地干預HOXB9基因的非正常表達，以降低其對治療的抵抗力。然而本研究中的樣本很少，其結論缺乏臨床證據證明。因此本項研究的可信度需要通過今后的進一步相關研究加以驗證，以指導臨床患者的化療。

綜上所述，HOXB9基因與MGMT、P-gP、hMSH2和hMLH密切相關，是膠質瘤患者采用替莫唑胺化療后耐藥的危險因素。建議在進行替莫唑胺化療前，可對腦膠質瘤患者進行HOXB9基因表達監測，對于表達非正常的患者，及時進行針對性干預，有利于降低接受替莫唑胺化療的腦膠質瘤患者的耐藥率。