3H與14C放射性標記化合物發展現狀

黃 偉，陳寶軍，趙思倩

(中國原子能科學研究院，北京 102413)

放射性標記化合物是指用放射性核素取代分子的一種或幾種原子，使之能被放射性探測技術識別用作示蹤劑的化合物。采用放射性標記化合物的示蹤檢測技術，具有靈敏度高、干擾少、方法簡便、準確性好等優點，在研究物質分布、揭示反應機制、闡明遷移過程、微量物質分析、生物活性測定、醫學臨床診斷等方面扮演著重要的角色，已廣泛地應用在工業、農業、醫學及科學研究的各個領域[1-4]。用于制備放射性標記化合物的放射性核素主要有3H、14C、32P、35S、125I等。3H是純β衰變核素，主要β射線能量18.6 KeV，半衰期12.3年，3H標記化合物具有高比活度的特點。14C也是純β衰變核素，主要β射線能量156 KeV，半衰期5 730年，在空氣中的最大射程為22 cm。3H與14C標記化合物作為示蹤劑具有半衰期長，應用時不需要考慮衰變校正，放射性能量低因而防護容易，對操作人員輻射損傷小；毒性低、檢測靈敏度高等優點。3H與14C還是生命元素的同位素，在制備標記化合物時不會影響該化合物的生物活性。由于3H與14C標記化合物具有的諸多優點，因而廣泛地應用于生物技術、醫藥開發、農業、工業等領域。隨著國家新藥創新研究的開展，對3H與14C標記化合物的需求也在日漸增加。本文總結3H與14C標記化合物制備方法，分析應用領域，回顧國內發展情況，希望能促進3H與14C標記化合物的發展，滿足國內科學研究對放射性標記化合物的需求。

1 3H與14C標記化合物的制備

1.1 3H標記化合物的制備

根據3H在標記分子中的位置是否確定，3H標記化合物的制備方法分可為定位標記和非定位標記兩類。非定位標記是3H在標記分子中的標記位置不固定的一類標記方法，而將3H局限于標記分子中指定位置的標記方法則為定位標記。非定位標記主要是通過同位素交換方法實現3H標記化合物的制備，標記過程簡便，對標記前體沒有特殊要求，幾乎可以實現所有含H化合物的3H標記。通過非定位標記制備的3H標記化合物一般比活度較低，3H在標記物的位置無法預先確定，一般用于對標記位置要求不高或其他標記方法無法實現的情況。

3H標記化合物的非定位制備方法主要有氚氣曝曬法、酸堿催化的同位素交換、金屬催化的同位素交換等[5]。氚氣曝曬法以3H2為原料，通過將標記底物放置在氚氣中直接H/3H交換進行標記，制備的3H標記化合物比活度低，放射性雜質多，目前已基本不再采用這種標記方法[5]。同位素交換法制備3H標記化合物更多是在催化劑條件下進行，應用的催化劑主要有Pd、Ir和Rh等貴金屬催化劑[5-6]，制備的3H標記化合物有芳香族化合物、碳氫化合物及核酸等。為促進同位素交換反應的進行，Ghanem等[7]提出了微波放電激活標記的方法，后經過改進完善成為一種有效的氚標記方法。這種氚標記方法通過對反應物施加微波激活，縮短了反應時間，同時還具有消耗氚氣少、標記產物比活度較高、雜質少、易純化、操作相對簡便等優點，這種方法適用于氨基酸、多肽、蛋白質等多種類化合物的標記。沈德存等[8]應用微波放電激活標記的方法研究制備了氚標記的環磷酸腺昔、皋丸酮等化合物。在金屬催化的同位素交換法標記基礎上，Myasoedov[9-10]等研究開發出了高溫固相催化同位素交換技術，固相反應以惰性化合物為載體(如碳、硫酸鋇、碳酸鈣、氧化鋁等)，將催化劑和反應底物覆蓋到固相載體上，在3H氣中加熱反應，反應溫度在100～200 ℃，反應時間在幾個小時以內。他們應用高溫固相催化同位素交換技術合成了雌酮、十六烷、反式玉米素等多種氚標記化合物，3H標記化合物的比活度在12.5～75.6 Ci/mmol。他們的研究表明，通過固相合成技術進行3H標記，標記效率與標記的有機化合物的熔點有關，低熔點化合物與高熔點化合物在固相催化同位素交換反應過程中的動力學不同。高熔點化合物在反應過程中隨著時間增加，標記效率會有一個平臺，而低熔點化合物在標記過程中隨著反應時間的增加會有一個峰值。高溫固相催化同位素交換相比在液相條件下的催化同位素交換方法所需反應時間短、標記物比活度高，但這種方法不適用于熱不穩定的標記底物。

3H標記化合物的定位制備方法主要是通過化學合成反應實現，包括氚鹵置換反應，氚氣還原不飽和鍵，金屬氚化物的還原，烷基金屬的氚水解等[6]。通過化學合成進行氚的定位標記一般所需的反應步驟較多，或對標記底物具有一定要求，如需先制備標記底物的鹵代物作為標記前體、標記底物中有適于加成的雙鍵或可以通過氫及氫化物還原的基團等。研究新的更簡便氚定位標記的方法主要有：(1)催化劑誘導控制3H標記位置；(2)溶劑誘導控制3H標記位置；(3)標記底物誘導控制3H標記位置。對同一個3H標記反應，使用不同的催化劑可以將3H定位標記到目標化合物的不同位置上。

Loh[11]等采用光引發的氫原子轉移(HAT)策略完成了三級胺氨基α位C(sp3)-H鍵的選擇性氚代研究，反應在Ir(Ⅲ)催化劑或有機分子催化劑1,2,3,5-四(咔唑-9-基)-4,6-二氰基苯(4Cz-IPN)的作用下，以硫醇作為HAT催化劑，采用廉價易得的T2O作為氫同位素來源便可實現以上過程。他們利用該方法在18種不同藥物分子中選擇性標記氚，標記物可以滿足藥代動力學研究的需求，實現了有效地、有選擇性地在a-氨基sp3碳-氫鍵一步標記氚。

Bokatzian-johnson[12]等系統研究了超聲和微波在3H標記糖類時的應用，開發出了選擇性的將3H標記到非還原性的糖或糖偶聯物上的方法。他們的研究發現，將催化劑經超聲處理，不論是在反應前還是在反應過程中，都會改善3H標記在室溫或更低溫度反應條件下的選擇性和反應速率。研究發現大部分的有機官能團(酮、酯、羧酸)在超聲條件下都會接受蘭尼鎳類型的催化劑。而一些典型常用的催化劑如Pd/C催化劑或者單獨的金屬鎳催化劑則不起作用。二相或三相混合金屬催化劑(如Ni-Al)則沒有催化效果。溶劑的種類以及反應底物上OH-或NH-上的保護基團的不同都會對3H標記的位置產生影響。

Zolotarev[10]等在研究高溫固相催化同位素交換反應時發現，當底物上有易還原基團(如硝基、雙鍵等)，通過控制標記條件就可能在這些還原基團上進行選擇性標記，標記的位置與3H的氣體壓力、反應溫度、選擇的催化劑有關。

1.2 14C標記化合物的制備

14C標記化合物主要都是通過化學合成法進行制備[6]，以Ba14CO3為起始原料，一般通過三種反應途徑實現14C 在不同位置的標記化合物。一是Ba14CO3加酸生成14CO2后與格氏試劑反應制備14C在羧基上的脂肪酸或芳香酸等一系列化合物；二是Ba14CO3經過金屬鎂還原生成Ba14C，水解后生成乙炔再經過環合反應后生成14C標記位置在苯環上的一系列化合物；三是還原成為K14CN，再鹵化物發生取代反應生成含14C標記的胺類化合物、氨基酸、嘌呤及嘧啶等標記化合物。

目前應用的14C標記化合物大部分都是通過上述合成方法制備，所需反應步驟較多，標記過程比較復雜。為了開發更簡便的14C標記化合物制備方法，Kingston[13]小組參考同位素交換法進行氚標記的策略，提出了一種類似的12C/14C交換的方法實現烷基羧酸的14C放射性標記。烷基羧酸的反應底物首先在鎳催化劑作用下與羥基鄰苯二甲酰亞胺形成氧化還原活性酯，然后在鎳催化作用下形成脫去羧基的中間體，該中間體與反應體系中的14CO2結合重新形成烷基羧酸。該方法已在20多個底物上進行了標記應用，放射性比活度最高可達到66 μCi/mg，較化學合成方法制備的14C標記化合物比活度低很多，但已經能用于多種藥物代謝和藥代動力學研究。該方法用于含羧酸化合物的高效14C放射性標記，12C/14C同位素交換在概念上類似于H/T同位素交換，是一種方便和操作簡單的14C標記方法，這些方法避免了多步的合成。通過在多個14C放射性標記反應中的應用，證明了該方法的實用性和操作簡便性，也為開發其他新的簡便14C標記方法提供了思路。

2 3H與14C標記化合物國內發展情況

上世紀七十年代，中國原子能科學研究院開展3H和14C標記化合物的研制，建立了標記化合物研究實驗室，形成了氣體爆射法、氚鹵交換法和微波標記法等多種核素標記方法，研制出3H、14C標記的近百種標記化合物[7,14]，同位素標記化合物從此作為放射性同位素應用的一個新門類在國內開始發展。八十至九十年代，中科院上海藥物研究所、天津醫藥科學研究所、軍事醫學科學院、中國農業科學院原子能利用研究所等單位相繼開展過相關的研究[15]。九十年代以后，由于多種原因，國內氚、碳-14等標記化合物研究紛紛終止或陷入停滯。

2010年以來隨著國家新藥創新研究對同位素標記化合物需求的增長，國內有關單位逐步恢復開展3H標記化合物的制備研究。中國原子能科學研究院與軍事醫學科學院合作建立同位素標記聯合實驗室，恢復開展3H及14C標記化合物的合成技術研究，已先后合成非定位和定位3H標記化合物數十種，設計并合成了鹽酸二氫埃托啡、鹽酸苯環壬酯、鹽酸戊乙奎醚等創新藥物的3H標記化合物。合成了14C標記的氰基丙烯酸正丁酯和14C標記羧甲基纖維素等化合物。目前國內具備3H和14C標記化合物研制能力的還有中科院上海應用物理研究所。此外國內一些公司也開展了14C標記產品的合成工作，如無錫貝塔醫藥科技有限公司建立了多種14C和13C前體化合物制備工藝，合成了14C標記的尿素等多種藥物小分子。

3 3H與14C標記化合物的應用

3.1 在新藥和醫療器械研發領域的應用

3H與14C標記化合物在新藥研究中主要作為示蹤劑來研究藥物在生物體中吸收、分布、代謝、排泄規律，考察藥物在體內的物質平衡及排除途徑，獲得組織分布數據，確定藥物在體內的清除機制，確定血液和排泄物中的代謝產物譜，研究藥物在體內的生物利用度等。14C標記化合物是國際上藥代動力學研究中經常采用的示蹤劑，國家藥品監督管理局藥品審評中心在2014年《藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》中正式將放射性同位素標記研究方法列入臨床前藥物代謝研究的指導原則。14C因其核素特性成為小分子藥物示蹤劑的首選，目前應用于藥代動力學研究中的放射性標記化合物中14C標記占比超過80%。3H的特性與14C接近，與之相比合成成本更為低廉，但由于3H標記化合物在體內降解過程中會形成3HO2，影響對藥物代謝性質的分析，從而限制了其應用。

近年來，3H與14C標記化合物也越來越多應用于可降解醫療器械的研發過程，對全面闡明可降解醫療器械植入體內后代謝和處置過程提供幫助，為醫療器械產品注冊和臨床安全應用打下基礎。

3.2 在農業領域的應用

3H與14C標記化合物對農藥學的發展起到了巨大的推動作用，3H與14C標記的農藥對于研究其在環境中的殘留、遷移和降解途徑，農藥在動植物體內的吸收、傳導、分布、代謝情況，農藥的作用機理等都發揮了重要作用，為制定農藥安全使用標準、科學合理使用農藥、控制農藥殘留及開發低毒、高效的農藥新品種等提供科學依據。我國的放射性同位素標記農藥的合成與示蹤研究始于上世紀60年代。浙江大學率先開展了農藥標記合成研究，先后利用14C、32P、35S、76As等多種放射性核素，研制了包括有機磷、有機氯、有機氮、有機砷的多種標記農藥，開拓了應用同位素示蹤技術研究農藥對環境污染及其防治的新領域[16]。中國農業科學院原子能利用研究所合成了主要包括有機磷、有機硫、有機氯、有機砷和有機汞等數十類放射性同位素標記農藥，利用同位素示蹤動力學理論和方法對六六六、乙酰甲胺磷、殺螟腈等多種標記農藥在農業生態系統中的環境行為與歸趨作了系統研究，為我國科學安全使用農藥做出了重要的貢獻。目前碳-14標記化合物仍在農藥開發中發揮著重要促進作用[17]。

3.3 在工業領域的應用

放射性標記化合物在工業上的一個重要應用是用于油田的示蹤[2]，如3H標記化合物等。示蹤劑監測技術通過向油田注入井中注入能夠與已注入的流體相溶的放射性示蹤劑,從而跟蹤已注入流體在油層中的運動軌跡,及其穿越油層后在生產井上檢測示蹤劑的產出濃度的變化,獲取示蹤劑響應曲線,從而分析油層信息和開采動態的方法。同位素示蹤劑是用于描述有關井間油層非均質性和流動性的重要手段,對評價剩余油分布,進而在整體上認識油水運動規律,以及對于油田二次采油和三次采油計劃的實施,都具有重要的現實意義。與傳統的化學示蹤相比，同位素示蹤技術具有明顯的技術先進性，其具有種類多，檢測靈敏度高，穩定性和通用性好，與地層流體配伍性好等優點。

3.4 在臨床上的應用

14C在醫藥領域的一個重要應用是用于14CO2呼氣檢測試劑，被檢者接受一定量14C標記的藥物，該藥物在被檢者體內的某一部位代謝后，產生14C標記的CO2氣體并呼出體外，通過檢測其含量等參數，來研究機體的代謝情況或反映器官的代謝功能。目前臨床上使用最廣泛的CO2呼氣試驗為14C-尿素呼氣試驗檢測胃幽門螺桿菌(Hp)，這是一種簡單、快速、靈敏、無創傷性的檢測方法，具有準確率高、無痛、無創、快速簡便、無交叉感染的優點。除已用于胃幽門螺桿菌感染診斷的14C-尿素外，用于肝臟功能診斷、胰腺疾病診斷、胃排空檢測、小腸細菌過度生長檢測、腸道吸收功能等檢測的14C標記藥物也在進行研究開發[18]。

4 展望

3H及14C標記化合物幾乎囊括了所有有機化合物的種類及含氫、碳的無機物。國際上以商品形式出售的14C標記化合物包括了氨基酸、多肽、蛋白質、糖類、核酸類、類脂類、類固醇類及醫學研究用的神經藥物、受體、維生素和其他藥物等，目前市場上能提供的3H或14C標記化合物品種已達1 300多種。約占所有放射性標記化合物的一半。作為商品開發的主要產品包括氨基酸及其衍生物、單糖類碳水化合物、化學中間體和試劑、放射性同位素標記的配體和臨床用制劑。

目前國內從事放射性標記化合物制備的單位比較少，其研制技術水平、產品品種、產業規模等與國際相比還有差距，大部分標記化合物還都依賴于國外進口。目前國際14C標記市場約占放射性同位素標記市場份額的一半以上，規模約7～10億美元，隨著生命科學和新藥研發需求的不斷擴大，各國政策法規中將放射性同位素標記作為重要的標準，市場空間有進一步擴大的趨勢。2019年國內放射性同位素標記化合物的市場大約在1 500～2 000萬元，還有很大的市場空間。近年來，國內除了科研院所外，已經有部分企業通過解決原料問題而在逐步介入這一領域。總體來看，目前放射性同位素標記的服務以綜合一體化為主。一是放射性同位素標記的定向委托和通用試劑的綜合一體化，國外的大型儀器設備提供商均是采取的這種模式；二是將放射性同位素標記與藥物代謝聯合的一體化服務。定向委托的一對一服務，屬于被動服務模式，依靠科研院所的資源優勢和影響承接委托的新藥合成、化合物標記等的服務。通用單體、原料和檢測試劑盒則是主動的服務。以兩者結合的方式更適合當前流行的模式。生命科學領域研究用的氨基酸、堿基、單糖等的標記有比較好的發展前景，可以考慮介入。隨著放射性同位素標記在新藥研究開發中應用的日益廣泛，通用型的研究工具，例如同位素標記的配體、受體、轉運體等的需求會不斷增加。

隨著質譜技術的發展，對穩定同位素的檢測靈敏度也在進一步提高，穩定同位素標記化合物在新藥開發、生命科學研究等領域的需求將進一步增加。作為示蹤劑的放射性標記化合物檢測靈敏度高的優勢在逐漸縮小，在3H及14C等放射性標記化合物的研究開發時必須面對穩定同位素競爭的局面，如何發揮放射性同位素的優勢，克服操作不便的缺點也是放射性標記化合物在未來發展時需要考慮的重要因素。