外泌體miRNA與胃癌關系的研究進展

魏守鑫，賈映東，余思佳

（1. 川北醫學院，四川 南充 637100 ；2. 遂寧市中心醫院，四川 遂寧 629000）

胃癌是指起源于胃黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，其惡性程度很高。近年來胃癌的發病率雖然有所下降，但其發病率在所有惡性腫瘤中仍居第四位，其致死率在所有惡性腫瘤中居第二位。目前，臨床上尚未徹底闡明胃癌的發病機制，一般認為此病的發生與患者飲食習慣不良、存在幽門螺桿菌感染、患有慢性萎縮性胃炎及遺傳因素等有關。早期胃癌患者通常無明顯的癥狀，少數患者可出現惡心、嘔吐、上腹部不適等類似胃炎或胃潰瘍的癥狀。因此，早期胃癌的確診率較低。多數胃癌患者的病情在得到確診時已發展至晚期，錯過了最佳的治療時機，其五年的生存率較低。目前，臨床上對胃癌患者主要是進行手術和（或）化療。盡管近年來針對胃癌的手術和化療已取得長足發展，但胃癌患者的預后仍然很差。針對胃癌患者的基因靶點進行干預，有望成為治療胃癌的新手段。近年來的研究發現，外泌體miRNA 與胃癌的發生、浸潤和轉移關系密切[1]。研究外泌體miRNA 與胃癌的關系可能為臨床上治療胃癌找到一條新途徑。本文主要是介紹外泌體miRNA 與胃癌關系的研究進展。

1 外泌體的結構和功能

1983 年，外泌體首次于綿羊的網織紅細胞中被發現。外泌體是一種由細胞內溶酶體微粒內陷形成的雙層盤狀囊泡小體，其直徑為40 ～150 nm，其內包裹著大量的蛋白質、脂質DNA、miRNA、mRNA、長鏈非編碼RNA 和其他遺傳物質。起初人們認為外泌體的形成僅僅只是細胞排泄廢物的一種方式，但隨后的研究發現，外泌體可在細胞間起到信息傳遞的作用，參與抗原提呈、免疫調節等，并與老年癡呆、不孕癥、病毒感染等多種疾病的發生發展有關。在腫瘤細胞中，外泌體的作用尤為突出，與腫瘤細胞的血管生成、轉移、耐藥性的出現及免疫抑制等密切相關[2]。人體的所有細胞均可分泌外泌體，但腫瘤細胞分泌外泌體更為活躍。外泌體作為細胞間的信使，可轉運miRNA、siRNA、蛋白質等物質，從而可促進腫瘤的發生發展。miRNA 是一類長度為19 ～25 個核苷酸的非編碼RNA 分子，其合成過程是：首先由細胞核內的多聚酶轉錄形成Pri-miRNA，經Drosha-DGCR8 復合物的切割，產生長度約為70 個核苷酸的per-miRNA，per-miRNA 與exportin5、RanGTP 等結合后被運往細胞質，最后由胞質內的Dicer 酶及TRBP 蛋白修飾成成熟的miRNA。miRNA 通過與目標mRNA 的 3’非編碼區結合，抑制其蛋白質的合成或直接降解目標mRNA，可對基因的表達產生負性調控作用[3]。miRNA 與目標mRNA的結合不需要完全遵守堿基配對規律，一種miRNA 可調控多種mRNA，一種mRNA 可接受多種miRNA 的調控。迄今為止，人們已發現2500 余種miRNA，有超過30% 的人類基因受到miRNA 的調控，其異常表達與包括胃癌在內多種癌癥的發生發展密切相關[4]。

2 外泌體miRNA 與胃癌的關系

2.1 外泌體miRNA 對胃癌的早期影響

2.1.1 外泌體miRNA 與腫瘤細胞增殖的關系 細胞的癌變往往伴隨著原癌基因的激活和抑癌基因的失調。外泌體作為細胞間信號傳遞的信使，在細胞癌變的過程中扮演著雙面角色。Shi 等[5]認為，胃癌細胞分泌的外泌體可將miRNA-221 傳遞至HGC-27 細胞，下調細胞周期素依賴的激酶抑制劑CDKN1B/p27 和CDKN1C/p57、促凋亡因子bmf 和bbc3/PUMA 的表達，以及下調PI3K/AKT 途徑抑制劑PTEN、細胞黏附調節因子PtPμ 和金屬肽酶抑制劑TIMP3 等多種腫瘤抑制物的表達而促進HGC-27 細胞的增殖。正常細胞分泌的外泌體可抑制腫瘤細胞的增殖，而腫瘤細胞分泌的外泌體可促進腫瘤細胞的增殖。研究發現，健康人胃黏膜上皮細胞分泌的miR-101 在PIM1 的3'UTR 區域具有特定的結合序列，可由外泌體轉運靶向PIM1 位點，進而可促進腫瘤細胞的凋亡。Wu 等[6]研究發現，早期胃癌患者血漿中miR-101的水平明顯低于健康人。

2.1.2 外泌體miRNA 與腫瘤微環境的關系 腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）是指由血管、細胞外基質、成纖維細胞、免疫細胞等構成的一個腫瘤細胞賴以生存和發展的復雜環境。外泌體miRNA 可在一定程度上改變TME，影響腫瘤細胞的生長。血管將營養物質運送到各個細胞內以供細胞的生長。腫瘤細胞的生長方式亦不例外。有研究指出，直徑超過1 mm 的惡性腫瘤必須依賴新生毛細血管才能得以生存，因此腫瘤細胞的生長必定伴隨著大量新生毛細血管的生成[7]。外泌體可通過攜帶miRNA 促進腫瘤內新血管的生成。例如，胃癌細胞分泌的外泌體中的miR-135b 可抑制FOXO1 蛋白的釋放，進而升高血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血漿中的表達水平，促進腫瘤內新血管的生成[8]。Zhang 等[9]研究發現，M2 巨噬細胞分泌的外泌體中的miR-130b-3p 可作用于染色體7q36.1 上的MLL3 基因，抑制轉錄因子粒狀頭樣2 的表達，促進胃癌病灶內新血管的生成。此外，外泌體也可直接轉運VEGF、長鏈非編碼RNA 和基質金屬蛋白酶等，促進腫瘤內新血管的生成。值得一提的是，腫瘤細胞早期增殖的速度較快，可導致TME 缺氧，而缺氧環境可使腫瘤細胞外泌體的分泌增多，從而促進腫瘤內新血管的生成[10]。

2.2 外泌體miRNA 對胃癌侵襲轉移的影響

胃癌的轉移是其進展的重要過程，也是影響此病患者預后的重要因素。胃癌的主要轉移方式包括腫瘤細胞直接浸潤、淋巴轉移、血行轉移及種植轉移。細胞外基質（extracellular matrix，ECM）是腫瘤細胞轉移的重要組織屏障，腫瘤細胞的侵襲轉移往往伴隨著ECM 的成分改變、降解等。腫瘤相關成纖維細胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAF）是腫瘤細胞基質的重要組成部分，大部分CAF 位于腫瘤與周圍間質的交界處或新生血管附近，可通過重塑ECM 的成分促進腫瘤細胞的轉移[11]。最新的研究表明，外泌體miRNA 可促進胃癌細胞的轉移。CAF 分泌的外泌體可被間皮細胞（mesothelial cells，MC）攝取，而外泌體攜帶的miR-106a 可抑制Smad7 的表達，導致α- 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和纖維連接蛋白的水平升高。α-SMA 是細胞骨架蛋白微絲系統的一部分，可為細胞運動和細胞內運輸提供動力，促進細胞的遷徙、凋亡、增殖等，并對MC 造成損傷，促進胃癌細胞的轉移[12]。Zheng 等[13]將胃癌細胞SGC-7901 與巨噬細胞分泌的外泌體進行共培養后發現，胃癌細胞中miR-223的表達水平顯著升高，腫瘤細胞的轉移能力顯著增強，其機制可能是巨噬細胞通過分泌外泌體傳遞miR-223，激活PTEN-PI3K/AKT 通路，促進胃癌細胞的轉移。Sung 等[14]研究發現，腫瘤細胞外泌體攜帶的整合素可與ECM 中的纖維連接蛋白結合，提供用于腫瘤細胞黏附和遷移的底物，進而可提高腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。外泌體也可通過促進腫瘤細胞表面侵入性偽足的形成而降解ECM，促進腫瘤細胞的轉移。而侵入性偽足又可作用于CD63 和Rab27a MVBs 位點，反饋性地促進腫瘤細胞分泌外泌體。除此以外，外泌體也可直接通過其自身攜帶的基質金屬蛋白酶、透明質酸降解ECM，促進胃癌細胞的轉移。

2.3 外泌體miRNA 在胃癌診療中的應用

2.3.1 外泌體miRNA 與腫瘤免疫逃逸的關系 程序性死亡 配 體-1（programmed death ligand-1，PD-L1） 是一種重要的免疫抑制分子，由CD274 基因編碼，并由MAPK、EGFR、PI3K-Akt、JAK-STAT 等 多 種 通 路 激活。PD-L1 與其受體蛋白PD-1 結合后可抑制T 淋巴細胞的活化、增殖和細胞因子的分泌，從而抑制T 淋巴細胞的抗腫瘤活性。越來越多的證據表明，包括胃癌細胞、乳腺癌細胞、黑色素瘤細胞等在內的多種腫瘤細胞均可通過上述方式逃避T 淋巴細胞的清除，PD-1/PD-L1 通路的激活已成為導致腫瘤免疫逃逸的關鍵機制[15]。腫瘤細胞分泌的外泌體除了可直接轉運PD-L、損害CD8+T淋巴細胞的功能而形成腫瘤免疫逃逸外，還可通過轉運miRNA 而加劇腫瘤免疫逃逸[16]。Li 等[17]研究發現，胃癌患者體內miR-675-3p 的表達水平較正常人明顯升高，通過分析其雙熒光素酶報告基因，證實miR-675-3p可與CXXC 型鋅指蛋白4 基因結合，通過MAPK 信號通路增強PD-L1 的表達，促進胃癌細胞的免疫逃逸。

2.3.2 外泌體miRNA 可作為新的診斷胃癌的血清腫瘤標志物 目前，臨床上主要是采用胃鏡檢查及胃鏡下活檢診斷胃癌。早期胃癌患者的病變較小，很難通過胃鏡檢查發現，且進行胃鏡檢查會給患者帶來一定的不適感，部分患者對檢查的依從性較差。現階段臨床上常用的診斷胃癌的血清腫瘤標志物有癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、 甲 胎 蛋（alpha-fetoprotein，AFP）、糖 類 抗 原125（carbohydrate antigen125，CA125）、CA724、CA242、CA199 等。但用上述血清腫瘤標志物診斷胃癌的靈敏度和特異度較低，且這些指標多用于評估胃癌患者術后病情復發的情況。故尋找一種新的血清腫瘤標志物用來診斷胃癌具有重要的意義。國外的研究發現，通過檢測血清外泌體miRNA 的表達水平可診斷胃癌。Tang 等[18]利用二代測序及生物信息學分析等方法篩選外泌體中的miR-92b-3p、let-7g-5p、miR-146b-5p 和miR-9-5p，并通過實時熒光定量逆轉錄- 聚合酶鏈反應加以驗證，通過計算ROC 曲線下面積（area under the curve，AUC）評價診斷的效能，發現用血清外泌體let-7g-5p 檢測診斷胃癌的AUC 為0.756、靈敏度為54%、特異度為88%；用血清外泌體miR-92b-3p檢測診斷胃癌的AUC 為0.714、靈敏度為54%、特異度為88%；用血清外泌體miR-146b-5p 檢測診斷胃癌的AUC 為0.674、靈敏度為46%、特異度為82% ；用血清外泌體miR-9-5p 檢測診斷胃癌的AUC 為0.626、靈敏度為50%、特異度為84%；用傳統的血清腫瘤標志物CEA 檢測診斷胃癌的AUC 為0.520、靈敏度為38%、特異度為70%；用血清外泌體miR-92b-3p、let-7g-5p 聯合檢測診斷胃癌的AUC 為0.775、靈敏度為64%、特異度為78%。由此可見，外泌體miR-92b-3p、let-7g-5p、miR-146b-5p、miR-9-5p 可作為新的血清腫瘤標志物用來診斷胃癌。

2.3.3 外泌體miRNA 與胃癌藥物治療的關系 化療是目前臨床上治療晚期胃癌的重要手段，常用的化療藥物有鉑類藥物和氟尿嘧啶類藥物。部分胃癌患者體內的腫瘤細胞易對化療藥物產生耐藥性，從而可影響其療效。研究指出，外泌體miRNA 的表達水平可影響胃癌細胞對化療藥物的耐藥性。Zheng 等[19]通過刺激小鼠骨髓獲得M2 巨噬細胞，并對M2 巨噬細胞分泌的外泌體進行miRNA 圖譜分析，發現外泌體miR-21 的表達水平升高；通過對小鼠進行進一步的體內實驗證實，外泌體miR-21 可從M2 巨噬細胞轉運至胃癌細胞，并經PTEN-PI3K-AKT 通路使PTEN 表達下調、AKT 活性增強，進而導致胃癌細胞對順鉑出現耐藥性。Zhang 等[20]通過分析兩組臨床病例樣本及進行小鼠體外實驗發現，外泌體miR-939 不僅能抑制胃癌細胞的生長、轉移，還能通過抑制SLC34A2/Raf/MEK/ERK 通路增強胃癌細胞對5-氟尿嘧啶的敏感性。值得注意的是，外泌體miRNA不僅可通過各自的通路增強或減弱腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，不同的miRNA 作用于同一通路也可能產生截然不同的效果。例如，外泌體miR-206 通過作用于MAPK 信號通路，可抑制p-MAPK3 蛋白的表達，進而降低胃癌細胞對順鉑的耐藥性；而外泌體microRNA-135b 通過作用于MAPK 信號通路，可抑制哺乳動物不育系20- 樣激酶1 的生成，使腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性[21]。臨床實踐證實，多種外泌體miRNA 可參與胃癌的微環境形成、增殖、轉移、凋亡等過程。抑制可促進腫瘤細胞生長的外泌體miRNA 的表達，或促進對腫瘤具有負向調控作用的外泌體miRNA 的表達，不失為一種治療胃癌的好方法。Guan 等[22]提出可利用高濃度的質子泵抑制劑抑制外泌體miRNA 的釋放，進而抑制CAF 的形成及相關細胞因子的釋放，達到治療胃癌的目的。外泌體miRNA 與胃癌藥物治療的關系詳見表1。

表1 外泌體miRNA 與胃癌藥物治療的關系

3 小結及展望

外泌體miRNA 現已被證實能夠參與胃癌的發生發展，在胃癌的診治中可發揮重要的作用。但關于外泌體miRNA促進胃癌發生發展的確切機制尚不清楚，各種miRNA 之間有無拮抗或協同效應也尚未明確。現階段，進行外泌體miRNA 檢測的成本高昂、步驟繁瑣，難以在臨床上推廣應用。因此，需尋找一種高效且成本低的外泌體miRNA 的檢測方法。在胃癌進展的不同階段，研究外泌體miRNA 與胃癌的關系，并有針對性地開發藥物制劑以促進或抑制外泌體miRNA 的表達，將成為臨床上治療胃癌的新方法、新途徑。