五個歐亞種釀酒葡萄果實類黃酮及香氣物質差異分析

趙一凡，彭文婷，李惠清，郭玉婷，王軍

（中國農業大學食品科學與營養工程學院葡萄與葡萄酒研究中心/農業農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

關鍵字：釀酒葡萄；花色苷；黃酮醇；黃烷-3-醇；揮發性香氣化合物

類黃酮類化合物是葡萄中重要的酚類物質，主要存在于葡萄的外果皮和種子中，包括花色苷、黃酮醇和黃烷醇等，對葡萄和葡萄酒的風味具有重要作用。花色苷是紅葡萄和紅葡萄酒顏色的主要來源，以C6-C3-C6為骨架，C環上C3位羥基經過糖苷化反應形成[1]，花色苷可進一步被酰基化修飾，生成乙酰化、香豆酰化和咖啡酰化的花色苷[2]，極大地豐富了花色苷的種類。黃酮醇主要以糖苷形式存在于葡萄的果皮中，能夠抵御紫外線對葡萄果實的傷害，清除氧自由基[3]，也可以與花色苷結合形成復合物，對葡萄酒起到輔色作用[4]。黃烷醇包括黃烷-3-醇單體和聚合黃烷-3-醇（原花色素），主要存在于葡萄的果皮和種子中，是葡萄中含量最豐富的類黃酮類物質，賦予葡萄酒以收斂性[5]。

香氣物質主要包括萜烯類、吡嗪類、降異戊二烯、醇類、醛酮類和酯類等，是評判葡萄果實和葡萄酒品質的重要指標之一。在葡萄果實中通常以游離態和結合態兩種形式存在，其中游離態組分對香氣有直接貢獻，結合態香氣沒有揮發性，但可以在葡萄酒釀造過程中被糖苷酶水解而釋放出游離態的苷元，通過累加、協同、抑制等相互作用對葡萄酒的風味質量和典型性起作用[6]。

類黃酮和香氣物質作為評價葡萄和葡萄酒質量的重要參數，其種類和含量受到基因型的影響。山葡萄總花色苷含量遠高于歐亞雜種，主要為花色苷雙糖苷[7]，不同顏色的葡萄品種中花色苷含量和比例存在差異[8]，不同歐亞種釀酒葡萄酚類物質含量也存在差異，各有特點[9-12]，種、品種和營養系之間的差異還導致香氣組成上的不同[13]。我國山葡萄‘雙紅’‘雙優’‘雙豐’中C6/C9類揮發性香氣物質含量顯著高于歐亞種葡萄[7]，‘黑比諾’4個營養系的果實香氣中，2,6-二叔丁基對苯醌和n-十六酸的含量有很大差異[14]。除上述內因外，類黃酮和香氣物質的種類和含量還受到光照[15-16]、水分[17-18]、溫度等[19-21]環境因素和疏穗[22-23]、摘葉[24-26]、避雨棚[27]等栽培措施的影響。雖然類黃酮及香氣物質的組成和含量因受外部環境因素的影響差別很大，但是不同品種的基因型是造成類黃酮及香氣物質存在差異的關鍵因素。例如，部分葡萄品種的花色苷組成較為穩定，不易受年份的影響[28]，而且果皮所含花色苷的種類及比例在一定程度上表現出葡萄的品種特性，因此可在某種條件下利用不同品種花色苷含量和組成的差異來區分葡萄品種甚至株系[7,29-30]。具有特殊的“黑胡椒”氣味的莎草奧酮是澳洲‘西拉’葡萄所釀造葡萄酒的特征香氣物，莎草奧酮的形成是因為萜烯合成酶基因VvTPS24的等位基因——倍半萜烯合成酶基因VvGuaS在葡萄果實中的不同表達，從而引起不同品種間萜烯物質含量差異[31]。

本研究利用高效液相色譜-質譜聯用（HPLC-MS）和氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術對‘馬貝克’‘馬瑟蘭’‘美樂’‘小味兒多’和‘西拉’5個歐亞種紅色釀酒葡萄的類黃酮和香氣物質進行了檢測，分析其類黃酮及香氣物質組成和含量差異，為釀酒葡萄品種鑒定和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試材

本試驗所用‘馬貝克’‘馬瑟蘭’‘美樂’‘小味兒多’和‘西拉’葡萄果實采自中國農業大學上莊實驗站智能玻璃溫室（40°08′12″N，116°10′45″E），除‘西拉’為2014年定植外，其余品種均定植于2013年。南北行向，栽培密度為4 m×1 m，主干高度為2.2 m，水平葉幕，每株留梢量為20～40個。

在葡萄果實成熟期（E-L38）進行采樣，每個品種隨機采取300粒發育良好且無病害的漿果，重復3次，放于冰盒中迅速運回實驗室。每個樣品一部分用于果實基本理化指標的檢測，另一部分液氮速凍后保存于-40 ℃冰箱中，用于果實類黃酮和香氣物質的分析。

1.1.2 試劑

色譜級甲醇、甲酸和乙腈，Fisher公司；D-(+)-葡萄糖酸δ-內酯、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、(+)-兒茶素、(?)-表兒茶素、(?)-表棓兒茶素、(?)-表兒茶素沒食子酸酯和1-己醇、月桂烯、檸檬烯、里那醇、α-萜品醇、β-香茅醇、檸檬醛、香葉基丙酮、4-甲基-2-戊醇等香氣標準品，Sigma-Aldrich公司；固相萃取柱Cleanert PEP-SPE，Bonna-Agela公司。

1.2 儀器與設備

手持糖度計：Atago公司；pH計：賽多利斯有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；Micro 17R離心機：賽默飛世爾公司；Agilent 1100系列配有二極管陣列檢測器（DAD）的LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-離子阱質譜聯用儀、Agilent 1200系列LC/MSD Trap-VL高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀、Agilent 1200系列配有可變波長檢測器（VWD）的高效液相色譜串聯Bruker系列離子阱質譜聯用儀、Agilent 6890 GC和Agilent 5975 MS氣相色譜與質譜聯用儀（GC-MS）：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化指標檢測

每個品種每個生物學重復隨機取100粒漿果，稱量粒質量；然后取果汁用于可溶性固形物、pH和可滴定酸等理化指標的檢測。可溶性固形物和pH值分別用手持糖度儀和pH計檢測，可滴定酸用酸堿滴定法測定，以酒石酸當量表示，單位g/L。

1.3.2 花色苷和黃酮醇提取與檢測

（1）花色苷和黃酮醇提取。每個品種每個生物學重復各取100粒漿果，液氮速凍后，手工剝皮。將剝下的果皮和種子低溫研磨成粉，再放于-40 ℃的真空冷凍干燥機中冷凍干燥至恒重，并將凍干粉保存于-40 ℃的冰箱待用。

花色苷和黃酮醇的提取參照Downey等[32]。準確稱取0.100 g果皮干粉放入2 mL離心管中，加入1 mL50%甲醇水溶液，低溫避光超聲萃取20 min后，在4 ℃的條件下8000 r/min離心5 min。然后將上清液轉移于新的離心管中，重復上述操作，將兩次提取的上清液充分混勻并保存在-40 ℃冰箱。

（2）花色苷檢測。采用Agilent 1100系列液相色譜-離子阱質譜聯用儀，色譜柱為Kromasil C18色譜柱，柱溫50 ℃，進樣量30 μL，檢測波長525 nm，流速1 mL/min。洗脫流動相A和流動相B分別為水∶甲酸∶乙腈＝92∶2∶6（Vol）和水∶甲酸∶乙腈＝44∶2∶54（Vol）。洗脫程序為：0 min，0% B；1 min，10% B；18 min，25% B；20 min，25% B；30 min，40% B；35 min，70% B；40 min，100% B。

質譜采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式，離子掃描范圍為100～1500 m/z，霧化器壓力為30 psi，干燥氣流速為10 L/min，溫度為325 ℃，每個樣品重復進樣2次。花色苷定量采用外標法，外標物為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，花色苷含量均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計，單位為mg/kg FW。花色苷定量標準曲線為Y＝59.221X＋16.1128（R2＝0.9989）。

（3）黃酮醇檢測。采用Agilent 1200系列高效液相色譜儀串聯Bruker系列離子阱質譜儀，色譜柱為Zorbax SBC18。柱溫為40 ℃，進樣量為50 μL，檢測波長為360 nm。流動相A為乙腈∶甲酸∶水＝50∶85∶865，流動相B為乙腈：甲醇∶甲酸∶水＝250∶450∶85∶215，流動相的流速為0.63 mL/min。洗脫程序如下：0 min，0% B；24.2 min，14.2% B；27 min，15.7% B；33.4 min，18.8% B；39 min，23.5% B；45 min，26% B；47 min，27.4% B；51.6 min，32% B；61.8 min，40% B；67.8 min，100% B；78.4 min，0% B。

質譜采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式，離子掃描范圍為0～1000 m/z，霧化氣壓力為30 psi，干燥氣流速為10 L/min，溫度為325 ℃。黃酮醇定量采用外標法，外標物為槲皮素-3-O-葡萄糖苷，黃酮醇以槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量計，單位為mg/kg FW。黃酮醇定量標準曲線為Y＝59.029X－42.801（R2＝0.9970）。

1.3.3 黃烷醇提取與檢測

（1）黃烷醇提取。游離黃烷醇提取參照梁娜娜[33]。準確稱取0.100 g果皮或種子的凍干粉于2 mL離心管中，加入1 mL含0.5%抗壞血酸的70%丙酮水溶液，充分震蕩5 min后在4 ℃的溫度下以8000 r/min離心10 min，后將上清液轉移至新的5 mL離心管中。重復兩次上述步驟，將3次提取的上清液合并，取400 μL加入新的2 mL離心管中，在常溫避光條件下進行氮吹直至完全吹干，然后先后加入200 μL含1%鹽酸的甲醇和200 μL的0.2 mol/L乙酸鈉水溶液進行溶解、中和，最后將提取液保存于-40 ℃冰箱中待用。

裂解黃烷醇的提取方法參照梁娜娜等[33]。準確稱取0.050 g果皮或種子的凍干粉于2 mL離心管中，加入500 μL間苯三酚緩沖液（0.5%抗壞血酸，0.3 mol/L鹽酸，50 g/L間苯三酚甲醇），在50 ℃的條件下避光水浴20 min后，加入500 μL的0.2 mol/L乙酸鈉終止反應，充分混勻后在4 ℃條件下8000 r/min離心15 min，將上清液轉移至新的5 mL離心管中，重復兩次上述步驟，合并3次提取的上清液，并保存于-40°C的冰箱中待用。

（2）黃烷醇檢測。黃烷醇采用Agilent 1200系列高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀進行定量檢測。色譜柱為Poroshell 120 EC-C18column。柱溫為55 ℃，進樣量為1 μL，檢測波長為280 nm，流速為0.4 mL/min。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為含0.1%甲酸的50%甲醇乙腈溶液。洗脫程序如下：0～28 min，10%～46% B；28～29 min，46%～10% B。

質譜采用電噴霧離子源，負離子模式，霧化氣壓力為35 psi，干燥氣流速12 L/h，溫度350 ℃，噴霧電壓4 kV，采用多反應監測模式（MRM）對目標化合物進行分析。黃烷醇定量時，4種黃烷醇的含量分別以兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表棓兒茶素（EGC）和表兒茶素沒食子酸酯（ECG）為外標物進行計算，單位為mg/kg FW。

定量標準曲線，兒茶素：Y＝965.16X＋558.87（Y＜20 000，R2＝0.9997），Y＝526.93X＋17 110（Y≥20000，R2＝0.9972）；表兒茶素：Y＝1407.6X＋929.52（Y＜30 000，R2＝0.9992），Y＝444.48X＋28 086（Y≥30 000，R2＝0.9991）；表兒茶素沒食子酸酯：Y＝2850.6X＋3503.3（Y＜50 000，R2＝0.9981），Y＝710.51X＋137 514（Y≥50 000，R2＝0.9979）；表棓兒茶素：Y＝19.42X－28.647（R2＝0.9981）。

1.3.4 香氣物質提取與檢測

（1）香氣物質提取。游離態香氣物質提取：從-40 ℃的冰箱中取出樣品，每個品種取果實50 g，液氮速凍后，除去果柄和種子，加入0.5 g D-(+)-葡萄糖酸內酯和2 g聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）后將果皮和果肉研磨成粉末，并置于4 ℃冰箱中靜置浸提4 h。后在4 ℃下以8000 r/min的轉速離心15 min得到澄清葡萄汁，一部分直接用于檢測游離態香氣，另一部分用于提取糖苷結合態香氣物質。

結合態香氣物質的提取：葡萄果實糖苷結合態香氣物質的提取參照蘭義賓等[34]。在活化后的固相萃取柱中加入1 mL上述澄清葡萄汁，然后依次加入5 mL的蒸餾水和5 mL的二氯甲烷，最后用20 mL甲醇將結合態的香氣物質洗脫下來并收集洗脫液至50 mL的圓底燒瓶內。用真空旋轉蒸發儀蒸干上述洗脫液，然后用5 mL 0.2 mol/L檸檬酸/磷酸氫二鈉緩沖液（pH＝5）重新溶解，轉移至新離心管中，加入100 μL 100 mg/L的糖苷酶（AR 2000），置于40 ℃培養箱中16 h。

（2）香氣物質檢測。利用本實驗室已優化的頂空固相微萃取-氣相質譜（HS-SPME-GC/MS）聯用方法分析葡萄果實中的香氣物質[35-36]。

將5.0 mL上述提取的澄清葡萄汁加入到20 mL香氣進樣瓶中，加入1.00 g NaCl和10 μL 1.0018 mg/mL的內標溶液（4-甲基-2-戊醇），并迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的蓋子擰緊，置于CTC-PAL自動進樣裝置上加熱攪拌30 min。然后將已活化的SPME萃取頭插入進樣小瓶的頂空部分，在40 ℃下繼續加熱攪拌30 min，待揮發性成分在液體、頂空和SPME三相中達到平衡時，取出SPME萃取頭，立即插入GC/MS進樣口，在250 ℃條件下解析8 min。每個樣品萃取兩次。

所用毛細管柱為HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm ×0.25 μm），載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。升溫程序如下：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升溫至220 ℃保持5 min。其他條件如下：進樣口溫度250 ℃，采取不分流模式，電離方式為電子轟擊離子源，電離能70 ev，離子源溫度230 ℃，質譜接口溫度280 ℃，質量掃描范圍30～350 u。

揮發性香氣物質定性分析根據NIST08標準譜庫中的保留指數和質譜信息進行，采用內標法進行定量分析。對于有標準品的香氣物質根據其標準曲線進行定量，對于沒有標準品的香氣物質利用具有相同化學結構或相近碳原子數的標準品進行相對定量，葡萄果實中香氣物質的含量表示為μg/kg FW。

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2019軟件進行數據的整理，平均值、標準差和單因素方差分析均采用SPSS 23.0軟件處理。采用Origin 9.0軟件對果皮中的花色苷和黃酮醇的數據進行作圖分析。采用SIMCA 14.0進行正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 果實理化指標

表1為供試釀酒葡萄品種成熟期果實的可溶性固形物、pH、可滴定酸和百粒漿果質量等基本理化指標的檢測結果。5個釀酒葡萄品種的可溶性固形物含量介于18.35%～21.60%，其中‘西拉’的可溶性固形物最高，‘馬貝克’的可溶性固形物最低，比‘西拉’低3.25%。供試品種果汁pH在3.22～3.69，可滴定酸含量在6.74～9.0 g/L，其中‘美樂’葡萄果實的酸度較高，可滴定酸含量最大，pH較低，為3.32。比較5個品種的漿果質量可以看出，‘馬貝克’的百粒漿果質量最大（162.39 g），其次是‘西拉’和‘美樂’，而‘馬瑟蘭’和‘小味兒多’的漿果質量較小。

表1 五個釀酒葡萄品種果實理化指標Table 1 Physiochemical parameters of five winegrape varieties

2.2 花色苷

對5個供試釀酒葡萄品種果皮中不同花色素類花色苷的含量進行分析（表2），其中，‘馬瑟蘭’的總花色苷含量最大，為1379.98 mg/kg FW；‘美樂’的總花色苷含量最小，約為‘馬瑟蘭’總花色苷含量的24%，顯著低于其余4個品種。所有供試品種均含有豐富的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-反式香豆酰葡萄糖苷等花色苷，其中‘馬瑟蘭’的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最大，為478.53 mg/kg FW。

表2 五個釀酒葡萄品種果皮中花色苷含量Table 2 The anthocyanin content in the skin of five winegrape varieties mg/kg FW

對供試品種果皮花色苷的種類進行分析（圖1 A），發現在檢測到的花青素類、花翠素類、甲基花青素類、甲基花翠素類和二甲基花翠素類等5種類型的花色苷中，所有品種中均以二甲花翠素類花色苷為主，其次為甲基花青素類花色苷或甲基花翠素類花色苷，而花翠素類花色苷和花青素類花色苷的積累量較少。二甲花翠素類花色苷在‘馬貝克’‘馬瑟蘭’和‘小味兒多’中的相對含量較高，而‘美樂’和‘西拉’中二甲花翠素類花色苷的相對含量較低。甲基花青素類的花色苷在‘美樂’和‘西拉’的總花色苷中占較高比例，如‘西拉’中的甲基花青素-3-葡萄糖苷的含量為352.09 mg/kg FW，顯著高于其他品種，是它們的4～6倍，占到總花色苷含量30%以上，而大多數品種中的花青素類花色苷或花翠素類花色苷的含量低于30 mg/kg FW，且不足總花色苷含量的3%，品種間差異明顯。

圖1 五個釀酒葡萄品種果皮花色苷種類（A）、酰化類型（B）、產生路徑（C）和甲基化類型（D）占比Figure 1 Composition of anthocyanins in the skin of five wine grape varieties

由圖1 B可知，不同種類酰化花色苷含量存在較大差異，所有供試品種中的酰化花色苷含量均占到總花色苷含量的一半以上，其中‘馬貝克’和‘西拉’的酰化花色苷占比較大，其次為‘小味兒多’，而‘馬瑟蘭’和‘美樂’的酰化花色苷的占比較小。在花色苷酰化類型上，咖啡酰化的花色苷相對于乙酰化和香豆酰化的花色苷占比最小，‘馬貝克’和‘馬瑟蘭’中幾乎未檢測到咖啡酰化的花色苷，‘馬貝克’和‘西拉’中香豆酰化花色苷所占的比例高于乙酰化，分別是乙酰化花色苷的4倍和2倍，而‘馬瑟蘭’‘美樂’和‘小味兒多’的乙酰化花色苷所占的比例高于香豆酰化花色苷，占到總花色苷含量的30%左右。

根據花色素B環上取代基的位置和數量，可將花色苷分為兩類：由花青素、甲基花青素及其酰基化花色苷組成的3'-OH取代的花色苷衍生物和由花翠素、甲基花翠素、二甲基花翠素及其酰化花色苷組成的3'5'-OH取代的花色苷衍生物。如圖1 C所示，‘馬貝克’和‘馬瑟蘭’F3'5'H路徑的花色苷占比較大，即花翠素衍生物的積累大于花青素衍生物的積累，果實顏色更偏向藍色色調，而‘美樂’和‘西拉’中F3'H路徑的花色苷占比較大，花青素衍生物的積累量較為豐富。

如圖1 D所示，不同品種花色苷的甲基化程度也存在較大差異，‘馬貝克’花色苷的甲基化程度顯著高于其他品種。

2.3 果皮黃酮醇

由表3可知，‘馬瑟蘭’的總黃酮醇含量最高，為132.32 mg/kg FW；‘美樂’的總黃酮醇含量顯著低于其他品種，僅為其他品種的34%～59%。在所有種類的黃酮醇中，‘馬貝克’‘美樂’‘小味兒多’和‘西拉’的槲皮素-3-O-半乳糖苷含量較高，為10.63～36.56 mg/kg FW，而山奈酚-3-O-葡萄糖半乳糖苷的含量較低，在6 mg/kg FW以下。

在檢測出的山奈酚類、槲皮素類、異鼠李素、楊梅酮類、西伯利亞落葉松黃酮和丁香亭等6類黃酮醇中（圖2 A）均以槲皮素類為主，為23.21～81.23 mg/kg FW，占到其黃酮醇總量的48%～62%，其次為山奈酚類或楊梅酮類，而異鼠李素、西伯利亞落葉松黃酮和丁香亭的含量較低，大多在10 mg/kg FW以下。此外，‘馬貝克’中積累了較為豐富的山奈酚類黃酮醇，是除‘小味兒多’外其余3個品種的5～6倍，約占黃酮醇總量的24%，表明其F3'H路徑的黃酮醇較為豐富。

結合表3和圖2 B可知，‘小味兒多’的丁香亭和楊梅酮類黃酮醇的含量顯著低于其他品種，均低于5 mg/kg FW，且其F3'5'H路徑的產物積累較少，僅約為總黃酮醇含量的13%，而其他品種該路徑所產生的黃酮醇均占到總黃酮醇含量的25%以上。5個供試品種F3'H路徑黃酮醇約占總黃酮醇的50%～72%，F3'H路徑的黃酮醇在‘馬瑟蘭’和‘小味兒多’中積累較為豐富，而在‘馬貝克’中的積累量顯著較低。

表3 五個釀酒葡萄品種果皮黃酮醇含量Table 3 The flavonol content in the skin of five wine grape varieties mg/kg FW

圖2 C中‘馬貝克’黃酮醇的甲基化修飾程度較低，其甲基化的黃酮醇只占到黃酮醇總量的15%左右。與之相比，‘馬瑟蘭’和‘美樂’黃酮醇的甲基化程度較高，其甲基化黃酮醇的占比均大于20%。

圖2 五個葡萄品種果皮中黃酮醇種類（A）、產生路徑（B）和甲基化類型（C）占比Figure 2 Composition of flavonols in the skin of five winegrape varieties

2.4 果皮和種子中黃烷-3-醇分析

對5個供試品種果皮和種子中黃烷-3-醇進行定性定量分析，結果如表4和表5所示。果皮和種子中的黃烷-3-醇分為游離單元、起始單元和延伸單元，其中延伸單元占比最大，其占到果皮中總黃烷-3-醇含量的90%以上，在種子中也得到類似的結果。游離單元在果皮總黃烷-3-醇含量中的占比最小，不足1%，且含量僅為9～22 mg/kg FW。

表4 五個釀酒葡萄品種果皮黃烷-3-醇含量Table 4 The flavanol-3-ol content in the skin of five wine grape varieties mg/kg FW

表5 五個釀酒葡萄品種種子黃烷-3-醇含量Table 5 The flavanol-3-ol content in the seed of five wine grape varieties mg/kg FW

果實中的總黃烷-3-醇主要以表兒茶素為主，含量最為豐富，而兒茶素、表棓兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯的含量相對較少。分析果皮和種子中的總黃烷-3-醇含量，‘馬貝克’‘西拉’和‘小味兒多’果皮中的總黃烷-3-醇含量較為豐富，而種子中的總黃烷-3-醇含量較少。與之相反，‘馬瑟蘭’和‘美樂’果皮中的總黃烷-3-醇含量顯著低于其他品種，而種子中卻含有相對較多的黃烷-3-醇。

平均聚合度為起始單元和延伸單元的總摩爾數與起始單元摩爾數的比值。不同品種果皮中黃烷-3-醇的平均聚合度存在顯著差異，其中‘小味兒多’果皮中的黃烷-3-醇的平均聚合度最高（67.9），約為其余品種的2～3倍，而‘馬瑟蘭’果皮中黃烷-3-醇的平均聚合度僅為23.33，平均聚合度最低。由此可見，5個供試品種果皮黃烷-3-醇的平均聚合度均高于種子，而種子中黃烷-3-醇的平均聚合度均未達到20。

2.5 香氣物質含量和組成

游離態香氣物質具有揮發性，其對葡萄的香氣有直接的貢獻，而非揮發性的結合態香氣，在葡萄酒釀造過程中經酶解或酸解可以釋放出具有揮發性的物質，對香氣有潛在的貢獻。如表6所示，5個供試品種中檢測到的香氣物質均以游離態香氣為主，其中‘馬貝克’的游離態香氣積累最為豐富，達到10 991.38 μg/kg FW，而‘美樂’的游離態香氣含量顯著低于‘馬貝克’，為5475.03 μg/kg FW。

游離態香氣物質中，C6/C9類的醛、醇和酯來源于酶促脂質氧化路徑，可賦予葡萄和葡萄酒典型的草本植物味和青草味，也被稱為綠葉氣味物質[37]。從表6可以看出，在游離態香氣物質中，C6/C9類含量最為豐富，除‘馬瑟蘭’外，所有供試品種的C6/C9類游離態香氣物質均占到總游離態香氣的85%以上，而C6/C9類的結合態類香氣僅占到總結合態香氣的12%～25%。‘馬瑟蘭’‘美樂’和‘西拉’均含有較多的游離態和結合態萜烯物質，顯著高于‘馬貝克’和‘小味兒多’。降異戊二烯類包括β-大馬士酮、β-紫羅蘭酮、茶螺烷和香葉基丙酮等物質，其感官閾值極低，是葡萄品種香的重要貢獻者[4,36]，游離態和結合態降異戊二烯類香氣在所有品種中的含量均低于50 μg/kg FW，積累量很少。醇類對于葡萄的香氣也有貢獻，在5個歐亞種葡萄品種中，‘美樂’中游離態醇類含量僅5.18 μg/kg FW，其它品種均在280 μg/kg FW左右；對結合態醇類物質來說，‘馬貝克’‘小味兒多’和‘西拉’中該類物質的含量顯著高于‘馬瑟蘭’和‘美樂’，均在1400 μg/kg FW以上。酯類物質可賦予葡萄和葡萄酒花香和成熟的果香[38]。就酯類而言，大部分品種的游離態和結合態酯類香氣的含量均＞500 μg/kg FW，而且游離態酯類的含量均高于結合態酯類，其中‘馬貝克’游離態酯類的含量最高，達到1017.08 μg/kg FW。

表6 五個釀酒葡萄品種果實游離態和結合態香氣物質含量Table 6 Free and bound aroma compounds content in the berries of five wine grape varieties μg/kg FW

綜上所述，不論是游離態香氣還是結合態香氣，不同種類的香氣在不同釀酒葡萄品種的含量和組成均存在較大差異，是區分葡萄品種的重要指標。

2.6 類黃酮和香氣物質OPLS-DA分析

利用OPLS-DA分別對5個供試品種成熟期葡萄果實類黃酮和香氣物質進行分析，所得OPLS-DA模型顯示不同供試品種之間存在區別，通過S-plot圖進行品種間差異物質篩選，得到VIP值＞1.5的類黃酮和香氣物質如表7所示，這些物質對于區分供試品種起到重要作用。

由表7可知，‘馬貝克’VIP值＞1.5的特征物質有4-甲基愈創木酚、結合態異胡薄荷醇、結合態萜烯類、游離態己烯醛、游離態C6/C9類等香氣物質和果皮黃烷醇和果皮表兒茶素等類黃酮物質，其中果皮中黃烷醇和游離態(E)-2-己烯醛、游離態C6/C9類在‘馬貝克’中更高；‘馬瑟蘭’VIP值＞1.5的特征物質有果皮和種子中黃烷醇、種子中表兒茶素和表棓兒茶素沒食子酸酯的延伸單元、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷、總花色苷以及結合態醇類等，其中果皮和種子中黃烷醇、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-乙酰葡萄糖苷、總花色苷等類黃酮物質在‘馬瑟蘭’中含量更高；‘美樂’VIP值＞1.5的特征物質有總花色苷、種子中黃烷醇和表兒茶素延伸單元、果皮中黃烷醇、游離態己烯醛、游離態C6/C9類、游離態酯類、游離態醇類、結合態苯乙醇和結合態醇類。除種子中黃烷醇外，其他特征物質含量均較低；‘小味兒多’VIP值＞1.5的特征物質有果皮中黃烷醇總量、果皮中表兒茶素延伸單元、游離態C6/C9類、結合態醇類、酯類、萜烯和其他香氣等； ‘西拉’VIP值＞1.5的特征物質有種子中黃烷醇、表兒茶素延伸單元、4-甲基愈創木酚、結合態苯乙醇、結合態醇類和結合態其他類香氣等。4-甲基愈創木酚、結合態苯乙醇、結合態醇類和結合態其他類香氣物質含量，4-甲基愈創木酚和結合態苯乙醇可以作為‘西拉’區別于其他品種的特征香氣物質。

表7 五個釀酒葡萄特征類黃酮和香氣物質VIP值Table 7 VIP value of characteristic flavonoids and aroma substances of five wine grapes

綜上可知，OPLS-DA可以篩選出各釀酒葡萄果實的特征物質，將不同品種區分開來。

3 討論與結論

不同釀酒葡萄品種的類黃酮及香氣物質的含量和組成存在較大差異，可作為區分葡萄品種的依據。邢婷婷等[12]研究結果表明，14個歐亞種釀酒葡萄的花色苷組成和含量存在明顯差異，可作為化學指紋區分不同品種，例如，‘西拉’和‘馬瑟蘭’總花色苷含量最高，‘馬貝克’花青素類花色苷含量較低，‘黑比諾’二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量最大，但不含酰化花色苷，而‘馬貝克’和‘西拉’的酰化花色苷積累量較豐富。李琪等[9]利用HPLC法檢測甘肅地區9個釀酒葡萄的組成和含量，其結果中‘美樂’總花色苷含量最高。在本試驗中，‘馬瑟蘭’的總花色苷含量最高，‘美樂’的總花色苷含量最低，可能是因為不同地區環境因素和栽培措施的影響，‘馬貝克’花色苷的甲基化和酰基化程度較高，與前人研究結果一致。姜文廣等[39]結合氣相色譜-質譜聯用和氣相色譜-聞香技術對‘蛇龍珠’‘赤霞珠’‘品麗珠’和‘美樂’等葡萄果實中的揮發性香氣進行檢測，發現不同葡萄品種香氣的種類相似，但香氣的強度存在較大差異。本試驗中，不同品種不同類別香氣物質含量和組成存在差異，其中，‘馬貝克’游離態香氣含量最高，C6/C9類香氣物質豐富，‘馬瑟蘭’C6/C9類游離態香氣物質含量較少，‘馬瑟蘭’‘美樂’和‘西拉’均含有較多的游離態和結合態萜烯物質，‘美樂’游離態醇類物質的積累量顯著低于其他品種，‘小味兒多’和‘西拉’結合態醇類的含量顯著高于‘馬瑟蘭’和‘美樂’。利用OPLS-DA模型能夠將所有品種完全區分。

本研究以中國農業大學上莊實驗站玻璃溫室種植的‘馬貝克’‘馬瑟蘭’‘美樂’‘小味兒多’‘西拉’等5個品種為實驗材料，測定成熟期釀酒葡萄果實類黃酮和香氣物質組成和含量。結果表明，除‘美樂’外，其他品種均含有豐富的花色苷，‘馬貝克’‘馬瑟蘭’中黃酮醇和黃烷醇含量較高，‘馬貝克’游離態C6/C9類、游離態酯類和結合態酯類香氣含量最高，‘馬瑟蘭’結合態萜烯含量最高，‘小味兒多’游離態和結合態降異戊二烯類、游離態醛酮類香氣含量最高，‘西拉’游離態萜烯和醇類香氣含量最高。‘馬貝克’‘馬瑟蘭’‘小味兒多’‘西拉’表現較好，具有種植潛力。