葡萄種質資源抗霜霉病鑒定研究

李東奎，許一博，王躍進

（西北農林科技大學園藝學院/旱區作物逆境生物學國家重點實驗室/農業農村部西北地區園藝作物生物與種質創制重點實驗室，陜西楊凌 712100）

葡萄是一種廣泛栽培的果樹，在世界和我國園藝作物中都有很高的經濟價值[1-2]。據世界糧農組織（FAO）數據顯示，2019年全球葡萄栽培面積達到692.6萬 hm2，總產量達到7713.9萬 t。其中，我國葡萄面積74.6萬 hm2，居世界第二位；葡萄產量達1437.2萬 t，居世界第一位。葡萄生產中的主栽品種以歐洲葡萄為主，品質好，風味佳，用途廣泛，但易感霜霉菌、白粉菌等真菌病害[3]。病害發生時，以化學方法噴藥為主，這不僅增加生產成本、造成環境污染，還會導致殺菌劑殘留，降低葡萄品質，造成巨大的經濟損失[4]。從長遠看，進行抗性育種是解決歐洲葡萄品種抗病性差的有效途徑。葡萄抗病育種的前提是擁有抗病的種質資源，中國作為葡萄屬植物的重要起源中心之一，擁有豐富的野生葡萄種質資源，對霜霉病表現出極好的抗性[2]。因此，對包括中國野生葡萄在內的種質資源進行抗霜霉病的田間自然鑒定，篩選抗病種質資源，對于抗霜霉病育種具有重要的科學意義。

霜霉病是葡萄最具破壞性的真菌病害之一，是由一種來自北美野生葡萄上的霜霉菌（Plasmopara viticola）引起[5]，后來通過砧木、接穗等途徑在歐洲各主產區傳播爆發，對歐洲葡萄與葡萄酒產業造成巨大的損失[4]。我國由于早期缺乏相應的檢驗檢疫措施導致霜霉病進入并大規模發病。葡萄霜霉菌主要侵染葉片，在環境條件適宜時，病菌在一個生長季內連續繁殖多代，導致病情呈暴發式發展，使樹體光合性能降低，光合產物合成受阻，從而影響葡萄產量和果實品質[6-7]。

在田間自然條件下，根據發病率調查葡萄種質資源發病情況。按照感病指數統計，將葡萄種質與株系的抗病性分成5級[8]。對中國野生葡萄10個種29個株系以及17個歐洲品種、9個歐美雜種進行霜霉病抗病性鑒定，篩選抗霜霉病的種質資源。同時，采用苯胺藍染色法，結合熒光顯微鏡技術對霜霉菌在抗病株系和感病品種中的侵染過程進行觀察，并利用實時熒光定量PCR檢測技術對葡萄霜霉菌抗病相關基因的表達進行分析，進一步證實葡萄種質資源的抗病表現，以期為葡萄抗霜霉病育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019—2020年在霜霉病流行后期的9月進行調查。田間自然抗病鑒定材料為中國野生葡萄10個種29個株系以及17個歐洲品種、9個美洲品種共計55份。田間試驗于西北農林科技大學葡萄種質資源圃進行，室內分析研究在國家旱區作物逆境生物學實驗室與農業部西北地區園藝作物生物與種質創制重點實驗室進行。

1.2 葡萄霜霉病田間抗病性鑒定

按照葉片感病面積占整個葉片面積的百分比，將葡萄抗霜霉病分為0～7共8個級別進行調查統計，然后用加權的方法統計出植株發病的感病指數[18]。計算公式如下：

感病指數＝Σ(病極值×該級發病葉數)/(調查總葉數×最高病極值)×100%

根據感病的嚴重程度把材料分成5級[8]。具體是：0為免疫或未發病；0.1～5.0為高抗；5.1～25.0為抗病；25.1～50.0為感病；50.1～100為高感。

1.3 葡萄葉片苯胺藍染色過程

苯胺藍染色液制備方法參考李卓[9]方法。取0.05 g苯胺藍溶于100 mL磷酸二氫鉀（0.067 Mol）中制備0.05%苯胺藍染色液。將霜霉菌孢子囊懸浮液（2 ×104cfu/mL）均勻噴灑在葡萄葉背并套袋。分別于接種后0、12、36、60、84 h取樣浸泡于0.05%苯胺藍染色液中過夜。將葉背面朝上放在載玻片上，用藍紫光觀察菌絲生長情況。

1.4 熒光定量PCR分析抗病基因的表達

實時熒光定量PCR的引物設計參照Cheng等[10-11]列于（表1），對‘丹鳳-2’‘塘尾’‘白玉霓’‘黑比諾’人工接種霜霉菌處理，于接種后0、12、24、48、72、96 h分別采樣提取RNA。提取方法參照Hipure Plant RNA Mini Kit試劑盒（Magen R4151-02）的說明書。反轉錄合成cDNA的方法參照SumOnetube RT Mixture Ⅲ（gDNA removal）試劑盒（夏末科技 SUM7806）的說明書。稀釋后的cDNA作為qRT-PCR的模板。以葡萄Actin為內參基因。實驗方法參考Shi[12]進行3 次生物學重復，每處理 3次技術重復。

表1 實時熒光定量引物Table 1 Real time-PCR reaction primers

1.5 數據統計與分析

用Excel軟件對大田統計數據進行整理分析，用Origin 8.0繪制實時熒光定量PCR數據分析圖。基因相對表達量的顯著性分析通過SPSS 25.0單因素方差分析的LSD法分析比較檢驗（P＜0.01）差異結果。

2 結果與分析

2.1 葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定

2.1.1 中國野生葡萄霜霉病田間自然抗病性鑒定

利用田間自然抗病鑒定的方法對中國野生葡萄10個種29個株系進行抗霜霉病鑒定（表2）。其中，中國野生種華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2，毛葡萄南鄭-1，復葉葡萄眉縣-6、白水-40、渭南-3，癭薁葡萄安林-2、安林-3對霜霉病有較高的抗性；復葉葡萄留壩-11、留壩-9為易感霜霉病株系。

表2 田間自然條件下中國野生葡萄對霜霉病的抗性鑒定Table 2 Identification of Chinese wild Vitis resistance to downy mildew under natural conditions in the field

圖1 人工接種霜霉菌侵染過程菌絲生長觀察Figure 1 Observation of the infection process of Plasmopara viticola inoculated hypha

2.1.2 歐洲種與歐美雜種葡萄霜霉病田間抗病性鑒定

利用田間自然抗病鑒定方法對17個歐洲種、9個歐美雜種進行抗霜霉病鑒定。其中歐美雜種‘瑞比爾’‘SO4’‘高妻’對霜霉病有較高的抗性；歐洲品種‘白詩南’‘法國藍’‘黑玫瑰’易感霜霉病（表3）。

表3 田間自然條件歐洲葡萄與歐美雜種葡萄對霜霉病的抗性鑒定Table 3 Identification of resistance European varieties and Euro-America hybrids to downy mildew under natural conditions in the field

2.2 田間人工接種霜霉菌的侵染菌絲觀察

利用人工接種的方法對抗病株系丹鳳-2，感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’進行人工接種霜霉菌處理，觀察侵染過程。發現丹鳳-2接種霜霉菌84 h后可觀察到初生菌絲；‘白玉霓’接種12 h后有初生菌絲，36 h后有分支的長菌絲，84 h后出現聚集成團的長菌絲；‘黑比諾’接種12 h后可觀察到長菌絲，36 h后可觀察到有分支的長菌絲，60 h后出現聚集成團的長菌絲，84 h后出現壞死；‘法國藍’接種12 h后可觀察到長菌絲， 36 h后可觀察到有分支的長菌絲，84 h后出現聚集成團的長菌絲。霜霉菌侵入‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’后，菌絲的生長和發育明顯快于丹鳳-2。

2.3 部分種質抗病相關基因表達水平

通過病原菌侵染觀察，對不同種質的入侵能力不同，這可能與組織結構有關，也可能與抗病基因表達后促進抵抗病原菌入侵的物質累積有關。對兩個中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’接種霜霉菌后進行qRT-PCR分析，通過檢測抗病相關基因的表達結果顯示，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達有顯著差異，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2的葉片接種霜霉菌12 h后苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達量顯著提高，芪合酶基因STS接種霜霉菌96 h后表達量顯著高于易感品種‘黑比諾’‘白玉霓’；中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾的葉片接種霜霉菌后病程相關基因非表達子NPR1基因均出現表達量遞減的情況；中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2、塘尾和兩個易病品種‘黑比諾’‘白玉霓’的葉片在人工接種霜霉菌后，類甜蛋白基因TLP均出現表達量遞增的趨勢。

圖2 不同葡萄接種霜霉菌處理后抗病相關基因差異表達Figure 2 Expression of disease resistance-related genes after Plasmopara viticola inoculation in different grapevinesA：苯丙氨酸解氨酶基因PAL基因相對表達量；B：芪合酶基因STS相對表達量；C：病程相關基因非表達子NPR1相對表達量；D：類甜蛋白基因TLP相對表達量。顯示為平均值±SD（n＝3）；a代表極顯著（P＜0.01）A:The relative expression of PAL gene; B: The relative expression of STS gene; C: The relative expression of NPR1; D:The relative expression of TLP. The data were showed as mean value±SD (n＝3).a highly significant (P＜0.01), respectively

3 討論與結論

中國蘊藏著豐富的野生葡萄種質資源[13]，鑒定這些資源的抗病性是抗病育種的前提。賀普超等提出中國野生葡萄抗霜霉病的鑒定方法并對中國野生葡萄21個種67個株系和部分歐洲品種進行抗病性鑒定認為，華東葡萄、燕山葡萄、瘤枝葡萄、復葉葡萄、秋葡萄對抗霜霉病具有良好的抗性[14]。本次田間自然抗病性鑒定也發現，中國野生葡萄華東葡萄商南-1、湖南-1、商南-2，復葉葡萄眉縣-6、白水-40，秋葡萄白河-22、平利-7等株系對霜霉病都有較高的抗性。Blaich利用人工接種方法對45個歐洲種、32個美洲種及26個歐美雜交子代進行接種霜霉菌處理，發現接種后歐洲種最容易表現癥狀，其次為歐美雜交子代，最不容易出現癥狀的為美洲種[15]。Bower以歐洲種為試材，利用田間自然抗病性鑒定法對29個歐洲種進行鑒定后認為，不同品種對霜霉病的抗性也不同[16]。Burruano利用人工接種霜霉菌的方法對不同葡萄品種接種后發現，霜霉菌在不同品種中的生長速度不同，其中霜霉菌在歐洲品種中生長最快[17]。本試驗田間自然抗病性鑒定也發現，中國野生種、歐美雜交子代對霜霉病的抗性普遍高于歐洲品種。利用苯胺藍染色的方法發現霜霉菌侵入感病的歐洲品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’后，其菌絲的生長和發育明顯快于侵入中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2；Trouvelot以18個歐洲種、11個美洲種為試材，人工接種霜霉菌的侵染過程發現，在接種霜霉菌5 d后，18個歐洲種中有17個出現壞死性病斑，而11個美洲種均沒有出現壞死性病斑[18]，這與本試驗結果類似。萬怡震等[19]對中國野生葡萄17個種的67個株系在自然條件下進行抗病性鑒定，發現多個株系對霜霉病抗性鑒定結果與本鑒定結果存在一定的差異，這可能與年份、樹齡及病原菌積累有關，這為進一步的研究提供了方向。Javier以21個美洲品種和60個歐洲品種為試材，利用離體接種鑒定的方法進行霜霉病抗性評價后認為，歐洲種對霜霉病的抗性普遍低于美洲種[20]。Toffolatti以美洲種、歐洲種以及歐美雜種為試材，人工接種霜霉菌后從組織結構抗性和生理生化抗性進行分析后認為，美洲葡萄對霜霉菌較高的抗性與葉片結構和抗病基因的表達有關[21]。

組織結構是植物抵抗真菌病害的重要器官[22]。在棉花、蠶豆、棗樹[23-25]等植物中都發現物理防御機制是植物抵御真菌侵染的重要方式。早期Marois以‘無核白’為試材利用氯仿溶劑除去葡萄表皮蠟質層后發現，‘無核白’對灰霉病的抗性顯著降低[26]；Selim以‘無核白’和‘雷司令’為試材利用實時熒光定量PCR技術分析后認為，葡萄葉片下表皮中的殼聚糖合成基因是響應霜霉菌侵染的重要基因[27]。Lema?tre-Guillier通過葡萄蛋白質組學分析認為，角質層是葡萄抵御霜霉菌侵染的重要屏障[28]。有學者采用轉錄和代謝組學分析認為，葡萄上表皮中的殼聚糖是抵御葡萄灰霉菌的重要物質[29-30]；韓蕊通過對不同抗性葡萄葉片與黑痘菌互作的超微結構觀察認為，葡萄對黑痘病的抗性與上表皮厚度有關[31]。林玲認為，毛葡萄葉背絨毛為阻礙霜霉菌的侵染發揮了重要作用[32]。本次通過對人工接菌后的中國野生毛葡萄抗病株系丹鳳-2，感病品種‘白玉霓’‘黑比諾’‘法國藍’侵染過程的觀察，認為丹鳳-2葉背絨毛是其抵抗霜霉菌侵染的屏障。

葡萄生理生化指標抗性是其抵御真菌侵染的重要途徑。苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達量和活性的提高能促進木質素及酚類等次生物質的合成，是植物抵抗真菌病害的關鍵基因[33]。本次實時熒光定量分析發現，中國野生葡萄抗病株系丹鳳-2在接種霜霉菌12 h后苯丙氨酸解氨酶基因PAL表達量顯著高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’；Vannozzi通過基因組學分析認為，芪類物質是葡萄抵御霜霉菌侵染的重要植保素之一[34]，Gamm以多個釀酒葡萄為試材，利用實時熒光定量分析技術發現多個抗病品種中的芪合酶基因STS在人工接種霜霉菌后會最先響應霜霉菌的誘導[35]，本次實時熒光定量分析發現，丹鳳-2接種霜霉菌后芪合酶基因STS表達量顯著高于易感品種‘黑比諾’與‘白玉霓’；TLP家族是病程相關蛋白家族之一，在植物中具有廣譜的抗真菌活性。通過抑制真菌酶活性，使真菌細胞膜透化，從而起到抵抗真菌侵染的作用[33]。Kortekamp分析多個抗病品種和易感品種中的PR蛋白編碼基因和苯丙類代謝相關基因的表達發現，抗病基因在抗病品種和易感品種中的表達有顯著差異，其中類甜蛋白基因TLP在抗病品種和易感品種中均有顯著表達[36]。本試驗RT-PCR分析發現，類甜蛋白基因TLP在抗病株系丹鳳-2接種霜霉菌后12 h表達量顯著提高；趙惠以3個抗病株系和3個感病株系為試材，利用實時熒光定量分析技術認為，TLP、NPR1在6個不同株系中響應霜霉菌侵染迅速，可能是葡萄調控霜霉病抗性的關鍵基因[11]，這與本次實時熒光定量分析結果不同，其原因可能與試材有關。

綜上，中國野生葡萄、歐洲葡萄、歐美雜種葡萄對霜霉病表現出抗病性差異，其中中國野生葡萄商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2、安林-3以及美洲品種‘瑞比爾’‘高妻’與砧木材料‘SO4’對霜霉病有較高的抗性，具有強的抗霜霉菌入侵以及抗病相關基因的上調表達能力。因此，中國野生葡萄抗霜霉病株系商南-1、湖南-1、商南-2、南鄭-1、白水-40、渭南-3、安林-2與安林-3是今后抗病育種可以利用的親本材料與抗病種質。