麻城黑山羊MC4R基因遺傳多態性及生物信息學分析

郭帥，楊娟，劉詩雨，楊豐利，熊琪，汪招雄

（1.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025；2.湖北省農科院畜牧獸醫研究所，武漢 430064）

MC4R（melanocortin receptor-4）是G蛋白偶聯受體超家族的一員，一種肽類物質，分泌部位在哺乳動物的下丘腦內側核。不僅存在于下丘腦，還廣泛存在于大腦皮質、丘腦、腦干和脊索等中樞神經系統中［1］。MC4R在大腦的食欲調節區域參與瘦素信號傳遞，是調節能量動態平衡的重要信號分子。MC4R能與內源性配體黑色素細胞刺激素（alpha melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）、刺鼠蛋白（agouti-signaling peptide，ASIP）及其相關蛋白（Agoutirelated proteins，AGRPs）結合［2］。α-MSH是阿片-促黑素細胞皮質素原（Proopiomelanocortin，POMC）的分解產物，為MC4R的內源性激動劑。ASIP及AGRPs等由外周神經元細胞合成，是MC4R的內源性拮抗劑［3］。MC4R通過與激動劑、拮抗劑的互作來控制食欲和維持體態。敲除MC4R基因小鼠表現出采食量增加、脂肪沉積變快以及胰島素過量分泌等特征［4］。

研究表明，MC4R基因是豬、牛、雞等畜禽重要經濟性狀的候選基因［5］。豬MC4R基因與脂肪性狀的關聯分析發現，與豬胸腰椎間膘厚、臀部膘厚、平均背膘、眼肌寬度、眼肌面積、皮率呈顯著相關［6］。牛MC4R基因與胴體性狀的關聯分析發現，與秦川牛背膘厚顯著相關［7］。雞MC4R不同基因型也與體重、全凈膛重、腿肉重等存在顯著或極顯著相關［8］。

麻城黑山羊是湖北省優良地方山羊品種，具有毛色純黑，耐粗飼，繁殖能力強，遺傳性能穩定等特點［9］。目前，關于麻城黑山羊MC4R基因遺傳多樣性及其功能的研究還未見報道。本研究通過基因測序，尋找麻城黑山羊MC4R的多態位點，并利用生物信息學方法，分析預測其結構和功能，為進一步研究MC4R基因及其自然突變體調節細胞信號轉導及影響麻城黑山羊生長代謝的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集及血液DNA提取

30只麻城黑山羊樣本采自湖北金旸（麻城）畜牧有限公司。山羊頸靜脈采血5 mL至肝素鈉抗凝管。采用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取血液基因組DNA。

1.2 引物設計及PCR擴增

根據NCBI中山羊MC4R基因序列（GenBank登陸號為NM_001285591.1），采用Primer Premier 5.0軟件設計引物（表1），交由武漢奧科生物公司合成。PCR擴增反應體系為25 μL，其中混合DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，滅菌雙蒸水9.5 μL。PCR擴增反應條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s，35個循環，最后72℃終延伸5 min，4℃保存。PCR產物送武漢奧科生物公司測序。

表1 麻城黑山羊MC4R基因擴增引物序列信息

1.3 多態性位點分析

利用DNAStar軟件的SeqManⅡ程序，將測序結果與MC4R基因參考序列進行分析比對，掃描SNPs位點。

1.4 等位基因頻率估算

將SNPs位點峰圖上傳至MWSnap應用軟件進行峰值測量，帶入公式對等位基因頻率進行估算［10］。

式中，?i表示SNP位點等位基因的頻率；hi表示測序圖上等位基因1或2峰值。

1.5 生物信息學分析

1.5.1 理化性質分析及疏水性結構預測 使用Ex-PAsY Protparam軟件對MC4R蛋白的相對分子質量（MW）和等電點（PI）等進行預測；使用在線軟件ProtScale對MC4R蛋白的疏水性結構進行預測。

1.5.2 MC4R的亞細胞定位、信號肽及跨膜結構預測 使用SignalIP 5.0版本軟件對信號肽進行預測分析，使用SubLoc V1.0軟件對MC4R亞細胞定位情況進行分析；使用TMHMM Server軟件對MC4R蛋白跨膜結構進行預測。

1.5.3 預測蛋白的糖基化位點和磷酸化位點 使用NetNGlyc在線軟件來預測麻城黑山羊MC4R蛋白的N-糖基化位點；使用NetOGlyc-4.0版本在線軟件預測麻城黑山羊MC4R蛋白的O-糖基化位點；使用Net Phos 3.1版本在線軟件來預測黑山羊MC4R蛋白的磷酸化位點。

1.5.4 二級結構預測 使用Predictprotein在線工具預測MC4R蛋白二級結構。

1.5.5 系統進化樹 下載綿羊、牛、豬、雞、犬等物種的MC4R氨基酸序列，與麻城黑山羊MC4R氨基酸序列一起上傳到NCBI中的Blast在線軟件進行多重序列比對，用MEGA構建系統發育樹，分析MC4R蛋白序列在不同物種間的進化情況。

1.5.6 結構域及功能位點預測 使用STRING在線軟件對MC4R蛋白結構域的功能位點進行預測。

2 結果與分析

2.1 麻城黑山羊MC4R基因的克隆

以混合DNA樣本為模板擴增MC4R基因CDS區序列，通過凝膠電泳來檢測擴增產物（圖1）。由圖1可知，PCR擴增條帶明亮，擴增出約1 000 bp的片段，與預測結果相符。

圖1 PCR擴增產物電泳結果

2.2 麻城黑山羊MC4R基因多態位點掃描

麻城黑山羊混池測序結果表明，在MC4R基因中共檢測到8個突變位點（圖2）。

圖2 麻城黑山羊MC4R突變位點

2.3 麻城黑山羊MC4R的等位基因頻率估算及突變類型分析

使用李平等［10］等位基因頻率估算的方法，用MWSnap軟件測量所有突變位點等位基因的峰高，并根據公式計算等位基因頻率。突變類型分析發現，麻城黑山羊MC4R基因第649號位點和第784號位點為同義突變，沒有導致氨基酸變化；其余突變位點為錯義突變，氨基酸變化詳見表2。

表2 麻城黑山羊MC4R基因的SNPs等位基因頻率

2.4 麻城黑山羊MC4R蛋白的理化性質分析和疏水性結構預測

MC4R蛋白的分子式為C1664H2619N413O454S24，蛋白質相對分子質量為36 443.55 g/mol，理論等電點（PI）為7.52。MC4R氨基酸序列中亮氨酸（Leu）含量最多，占氨基酸總量的11.4%，色氨酸（Trp）含量最少，占氨基酸總量的0.9%，沒有吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。正、負電荷殘基數分別為16、17。不穩定系數為47.86（＞45為不穩定），提示MC4R為不穩定蛋白。蛋白親水性為0.778，說明MC4R為疏水蛋白。用ProtScale進一步對麻城黑山羊MC4R蛋白的疏水性結構進行預測分析（圖3），其親水性/疏水性最小值為-1.967，最大值為3.367，總體表現為疏水性，與前面的親水性分析相互驗證。

圖3 麻城黑山羊MC4R蛋白的疏水性結構

MC4R的8個突 變位點 中有2個即C617A和C649G，使蛋白質理化性質發生變化。突變后的相對分子質量變為36 488.04，理論PI值變為7.09，正電荷殘基數目變為17，仍然為不穩定疏水性蛋白。其余6個突變體的理化性質、蛋白親水性/疏水性值均未發生變化。

2.5 麻城黑山羊MC4R的亞細胞定位、信號肽以及跨膜結構分析

預測MC4R蛋白定位于細胞膜，其有信號肽的可能性較小（0.309%）。所有突變體的信號肽及亞細胞定位預測結果未見明顯變化，說明突變體可能不會引起MC4R蛋白信號肽及細胞定位的改變。

跨膜結構螺旋區對蛋白質功能的作用非常重要。分析MC4R蛋白的跨膜結構發現，MC4R蛋白有7個跨膜結構，屬于跨膜轉運蛋白（圖4）。跨膜片段分布見表3。所有突變體的跨膜結構沒有明顯改變。

圖4 麻城黑山羊MC4R跨膜區

表3 跨膜片段信息

2.6 麻城黑山羊MC4R的糖基化位點以及磷酸化位點預測

麻城黑山羊MC4R的N-糖基化位點預測結果見圖5，可能有5個N-糖基化位點，分別位于第2、17、26、97、108位的天冬酰胺殘基，表明MC4R蛋白可能具有N-糖基化機制。O-糖基化位點預測結果見圖6，共有10個O糖基化位點，說明MC4R蛋白可能具有O-糖基化機制。磷酸化位點預測結果見圖7，發現20個絲氨酸位點，6個蘇氨酸位點，1個賴氨酸位點，其對應激酶見表4。突變體的蛋白糖基化、磷酸化位點與野生型未見不同。

圖5 N-糖基化位點預測

圖6 O-糖基化位點預測

圖7 磷酸化位點預測

表4 磷酸化位點對應激酶

2.7 麻城黑山羊MC4R蛋白的二級結構預測分析

麻城黑山羊MC4R蛋白的二級結構分析結果見圖8，黑色為α螺旋，藍色為β折疊，紅色為無規則卷曲。其中α螺旋占53.7%，β折疊占6.2%，無規則卷曲占0.8%。對麻城黑山羊8個MC4R突變體的二級結構預測發現，C617A、C649G兩個突變體的二級結構發生變化，C617A突變體α螺旋變為26.6%，β折疊變為6.33%、無規則卷曲變為2.37%，其余6個突變體對蛋白質的二級結構無變化。

圖8 麻城黑山羊MC4R二級結構預測

2.8 構建麻城黑山羊MC4R蛋白的系統進化樹

利用NCBI中綿羊、人、豬、犬、牛等物種的MC4R氨基酸序列及麻城黑山羊MC4R氨基酸序列進行多重比對，構建不同物種的系統進化樹，結果見圖9。由圖9可知，麻城黑山羊MC4R氨基酸序列與綿羊的相似性為97.82%，與牛的相似性為94.50%，說明MC4R是保守蛋白，且麻城黑山羊與綿羊的MC4R處于一個分支，與牛的親緣關系較近，與雞的親緣關系最遠。

圖9 不同物種MC4R蛋白的系統進化樹

2.9 MC4R蛋白的互作蛋白預測

在STRIG交互式數據庫中搜索可能與MC4R蛋白相互作用的蛋白時發現，MC4R蛋白與POMC、NPS、IAPP、GCG、AGRP、GLP1R、GNB3、GIPR、CRHR1、CRH可能存在相互作用。

圖10 麻城黑山羊MC4R蛋白相互作用的蛋白預測

3 小結與討論

作為促腎上腺皮質素的受體，MC4R可介導腎上皮質腺類固醇的合成，參與其代謝及信號轉導過程，在調控糖脂代謝和胰島素分泌方面發揮重要作用。MC4R基因變異與人類較低的內臟脂肪積累和較高的餐后碳水化合物利用率具有關聯性［11］。敲除MC4R基因的小鼠，患有食欲亢進和肥胖［12］。MC4R還與葡萄糖穩態有關［13］，大鼠MC4R缺乏會使葡萄糖代謝累加，導致糖尿病［14］。MC4R可以與一些配體結合發揮調控體脂代謝的作用。如MC4R可以與天然內源配體α-MSH結合，從而抑制體重的增加［2］。MC4R還能高親和地與外源藥物激動劑setmelanotide結合，為瘦素受體缺陷型患者提供持久的減肥［15］。

MC4R基因在調控畜禽生長發育方面的研究較多。在杜洛克和地方品種豬雜交配種群中，MC4R基因影響脂肪酸的組成［6］。綿羊MC4R基因G1232A突變影響出生體重、斷奶體重和脂肪厚度［16］，G1232A突變與背膘厚度顯著相關［17］。MC4R是影響雞早期生長和肌肉性狀的主效基因［18］，不同MC4R基因型與雞體重極顯著相關［8］。江香豬G1392A突變導致精氨酸變為組氨酸，影響豬生長性狀和背膘厚度［19］。秦川牛A129G突變影響牛活重，C1069G突變與活重、屠體重、背膘厚、大理石紋顯著相關［7］。MC4R基因的多態性在育種過程中有潛在應用價值，是非常重要的分子標記。

麻城黑山羊MC4R基因有999 bp的完整CDS，編碼332個氨基酸，與綿羊的序列相似性達到97.82%。MC4R的互作蛋白主要有AGRP、CRHR1、GLP1R、GCG等，其中AGRP是機體內維持代謝穩態和能量平衡的重要神經元，對調節基礎代謝率、攝食、脂肪和糖代謝起重要作用［20］；GLP1R是胰高血糖素樣肽1受體，與cAMP信號通路、胰島素分泌有關［21］；GCG是胰高血糖素，與胰島素分泌、胰高血糖素信號通路有關［22］。因此，作為重要的配體，MC4R基因與血糖升高、體脂肪變化、能量代謝有密切關系［23］。本研究發現MC4R基因在麻城黑山羊中存在8個突變位點，并且C617A位點突變后會引起蛋白質理化性質以及蛋白二級結構發生變化。后期將針對這些突變位點，深入研究其配體結合能力、信號轉導功能，開展性狀關聯分析，闡明不同MC4R突變體對麻城黑山羊生長性狀的影響。

研究成功克隆麻城黑山羊MC4R基因序列，獲得了8個MC4R突變位點。生物信息學分析結果顯示，麻城黑山羊MC4R基因在哺乳動物中保守性較強。其理化性質和蛋白結構功能預測表明MC4R基因及其突變體很有可能參與麻城黑山羊血糖調控，體脂變化、能量代謝等生長代謝過程。