子癇前期孕婦TNF-α和MAPK信號轉導通路表達情況的研究

周 曉 李 垚 王 晨

江西省婦幼保健院產科，江西南昌 330006

子癇前期是一種妊娠期特有的疾病，以高血壓和蛋白尿為主要特征，并可累及循環、泌尿、消化、血液等多個系統[1]。目前在我國，它仍是導致孕產婦及圍生兒不良結局的主要原因之一[2]。子癇前期確切的發病機制尚未明確，但已證實多種信號轉導通路的異常與其發病過程密切相關[3]。促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK） 是細胞內重要的信息傳遞鏈[4]，參與細胞生長、分化、應激、炎癥反應等多種重要的生物學過程[5]。MAPK 通路包括4條主要分支路線[6]：細胞外信號調節蛋白激酶通路（extra cellular signal-regulated pro tein kinase，ERK）、c-Jun氨基末端激酶通路（c-Jun-N-terminal kinase，JNK）/應激激活蛋白（stress activated protein kinase，SAPK）、p38 MAPK 通路（p38 mitogen activated protein，p38 MAPK）和ERK5。JNK 和p38 與炎癥、凋亡及生長密切相關，而ERK 參與調控細胞生長、分化過程。目前國內尚未見MAPK 通路與子癇前期發病相關性的報道，本課題擬檢測子癇前期孕婦血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） 以及胎盤組織中MAPK 信號轉導通路的表達情況，為其發病機制的研究提供新的切入點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至12月因子癇前期于江西省婦幼保健院行剖宮產分娩的30 例單胎孕婦作為研究組，另選擇同期因瘢痕子宮、骨盆狹窄、胎位不正行剖宮產分娩的30 例單胎孕婦作為對照組。子癇前期納入標準參考人民衛生出版社《婦產科學》第九版[7]，入組患者簽署知情同意書。本研究經江西省婦幼保健院醫學倫理委員會審批通過。排除標準：①多胎妊娠；②孕婦合并有其他慢性病史，如心臟病、慢性腎炎、甲狀腺功能異常等； ③孕婦出現其他妊娠期并發癥，如妊娠期糖尿??；④胎兒畸形；⑤有輸血史及免疫治療史。兩組孕婦的年齡、孕齡、是否吸煙及孕產史方面比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（表1），具有可比性。

表1 兩組孕婦一般臨床資料比較

1.2 方法

1.2.1 標本采集 血清標本采集：患者入院后未用藥時于安靜狀態下采集肘靜脈血5 ml，室溫靜置4 h 后離心，取上層血清，放入-80℃冰箱保存。

胎盤標本采集：剖宮產術中胎盤娩出后立即取材，選擇胎盤母體面靠近臍帶根部2 cm×2 cm×2 cm 大小的組織，快速用生理鹽水沖洗后放入EP 管中，轉入液氮罐內速凍。另留取少量胎盤組織制成石蠟切片。

1.2.2 實驗步驟 采用ELISA 法檢測兩組孕婦血清樣本中TNF-α 的表達水平。本研究所用試劑盒購自北京中杉金橋生物工程有限公司，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

采用Western blot 法檢測兩組孕婦胎盤組織中MAPK 信號轉導通路相關蛋白（p-p38、p-JNK、p-ERK）及下游分子[核轉錄因子(nuclear transcription factor，NF）κBp65、c-fos、c-Jun]的表達情況。ECL 檢測試劑盒購自美國Pierce 公司，操作步驟按說明書進行。進行凝膠電泳時蛋白上樣量為30 μg，以β-actin 作為內參，采用Gel-ProAnalyzer 軟件分析印跡灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用ANOVA 方差分析和t 檢驗，采用Spearman 法分析研究組孕婦血清中TNF-α 表達水平與胎盤組織中p-p38、p-JNK、p-ERK 表達水平的相關性，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組孕婦血清中TNF-α 表達情況的比較

研究組孕婦血清中的TNF-α 表達水平為（1.65±0.15）pg/ml，高于對照組（0.81±0.14）pg/ml，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 兩組孕婦胎盤組織中MAPK 通路相關蛋白表達情況的比較

研究組的p-p38 和p-JNK 在胎盤組織的表達水平高于對照組，p-ERK 的表達水平低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2、圖1）。

表2 兩組孕婦胎盤組織中p-p38、p-JNK 和p-ERK 表達水平的比較（±s）

表2 兩組孕婦胎盤組織中p-p38、p-JNK 和p-ERK 表達水平的比較（±s）

組別 p-p38 p-JNK p-ERK對照組（n=30）研究組（n=30）t 值P 值0.55±0.17 1.93±0.26 32.68＜0.001 0.57±0.18 5.30±1.25 26.04＜0.001 0.81±0.16 0.22±0.09 25.85＜0.001

圖1 兩組孕婦胎盤組織中MAPK 通路相關蛋白的表達情況

2.3 TNF-α 與MAPK 通路相關蛋白的相關性分析

TNF-α 表達水平與p-p38、p-JNK 表達水平呈正相關（P＜0.05），與p-ERK 的表達水平呈負相關（P＜0.05）（表3）。

表3 p-p38、p-JNK、p-ERK 與TNF-α 的相關性分析

2.4 兩組孕婦胎盤組織中MAPK 通路下游分子表達情況的比較

研究組胎盤組織中NF-κBp65、c-fos 和c-Jun 的表達水平均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）（表4、圖2）。

圖2 兩組孕婦胎盤組織中MAPK 通路下游分子的表達情況

表4 兩組孕婦胎盤組織中MAPK通路下游分子表達情況的比較（s）

表4 兩組孕婦胎盤組織中MAPK通路下游分子表達情況的比較（s）

組別 NF-κBp65 c-fos c-Jun對照組（n=30）研究組（n=30）t 值P 值0.96±0.03 2.13±0.11 6.13＜0.001 0.72±0.19 2.68±2.25 5.05＜0.001 0.89±0.13 3.88±1.13 10.16＜0.001

3 討論

子癇前期是妊娠期嚴重的并發癥，發病率在3%～8%[8]，每年全世界約有7 萬名孕產婦因此而死亡[9]，并導致超5 萬圍生兒夭折[10]。對每一個產科醫生而言，這都是巨大挑戰。子癇前期的發病機制尚未完全明確，但大多數患者在胎盤娩出后表現為癥狀減輕或消失，故普遍認為胎盤的病理改變是子癇前期發病的基礎[11]。妊娠早期階段，滋養細胞侵入低下導致子宮螺旋動脈重鑄不良是子癇前期的起始性病理變化；隨著妊娠進展，胎盤缺血缺氧及氧化應激導致大量炎癥因子釋放是子癇前期向全身擴散的病理基礎。妊娠本身被認為是一種適度的炎癥反應[12]，但過度炎癥反應則可能導致病理妊娠過程。TNF-α 是重要的炎癥反應標志物，可反映機體的炎癥水平。有研究顯示，TNF-α表達水平上調與子癇前期的發生、發展密切相關[13]。TNF-α可通過多種途徑造成血管內皮細胞損傷，進而引起全身小動脈廣泛痙攣，最終導致子癇前期發病[14]。本研究結果顯示，TNF-α 在研究組孕婦血清中的表達水平高于對照組孕婦，差異有統計學意義（P＜0.05），也印證了上述結論。

MAPK 信號轉導通路包括：p38、JNK/SAPK、ERK以及ERK5 四條通路，這四條通路各司其職，將細胞質的信號傳遞至細胞核內[15]。有研究顯示，MAPK 信號通路與胎盤的發育密切相關： 如ERK 調控細胞生長和分化，JNK 和p38 MAPK 信號通路在炎癥和細胞凋亡等應激反應中發揮重要作用[16]。MAPK 信號轉導通路可被多種細胞外刺激因素激活，如炎性因子、生長因子和氧化應激等[17]。子癇前期患者胎盤滋養細胞缺血缺氧，進而引起全身炎癥反應，使MAPK 信號轉導通路被激活。本研究結果顯示，研究組胎盤組織MAPK 通路相關蛋白p-p38 和p-JNK 的表達明顯升高，進一步刺激TNF-α 表達上升，加重內皮受損程度。p-ERK 是多種生長因子的下游蛋白，調節細胞的生長、增殖和分化[18]。一方面，p-ERK 及其信號途徑接受大量來自生長因子、絲裂原、環境刺激等的信號，另一方面通過ERK 信號級聯反應作用于核轉錄因子如NF-κB 等，調控基因表達。子癇前期胎盤組織中，滋養細胞凋亡增多，而血管內皮細胞增生減少，導致p-ERK 的表達水平下降。

p-p38 和p-JNK 相似，同屬應激激活的蛋白激酶，不僅可被TNF-α、白介素1、熱休克蛋白等激活，還可進一步誘導單核巨噬細胞分泌產生炎性因子，并控制NF-κB、熱休克蛋白、凋亡蛋白等多種轉錄因子的表達活性[19]。在子癇前期的發病過程中，異常激活的MAPK信號轉導通路，尤其是p38 和JNK 通路，促進多種轉錄因子的激活，使通路下游分子NF-κBp65、c-fos 和c-Jun 表達水平升高，并與下游因子共同作用，促進炎性因子的分泌，加重病理過程。因此，本研究結果顯示，研究組血清TNF-α 水平與p-p38 和p-JNK 表達水平呈正相關（P＜0.05）。

綜上所述，MAPK 信號通路與子癇前期的發病密切相關，但具體作用機制仍需進一步分析。對MAPK信號通路及上下游分子的研究有望為子癇前期的發病機制提供新的切入點，并為其預防和治療提供新的思路。