多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1、凋亡誘導因子在卵巢癌組織中的表達及其臨床病理意義

秦翱翔 沈 力

湖北省荊州市松滋市中醫院腫瘤科，湖北荊州 434200

卵巢癌是女性生殖系統中常見的惡性腫瘤，具有高度侵襲性，因其隱匿性，確診時多為晚期，患者5年存活率較低，其已成為嚴重威脅婦女生命的惡性疾病[1-2]。因此，積極尋找能夠有效預測患者預后的分子標記物具有重要的意義。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1（poly adenosine diphosphate ribose polymerase 1，PARP1）是DNA 損傷修復的關鍵酶，主要存在于細胞核，少量存在于細胞質中，在腫瘤的發生發展中起重要作用。過度的DNA 損傷及PARP1 表達，會造成細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）耗竭，進而使得凋亡誘導因子（apoptosisinducing factor，AIF）及核酸內切酶G 從線粒體中釋放，進入細胞核，誘發非caspase3 途徑，最終導致細胞凋亡的發生[3-4]。細胞凋亡對于維持生物體正常發育起重要的作用，一旦凋亡調控機制發生紊亂，細胞惡變的潛能增高，最終可能轉化為腫瘤。AIF 是新發現的一種凋亡效應分子，既具有細胞凋亡活性又具有氧化還原酶活性，可以不依賴于caspase 途徑而行使細胞凋亡功能，在腫瘤細胞中呈現高表達，對細胞凋亡起促進作用[5-6]。目前，關于PARP1、AIF 在卵巢癌的研究未有報道，故本研究運用免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中PARP1、AIF 表達情況，并分析其與卵巢癌患者各項病理參數及預后的關系，以期為卵巢癌診療及預后提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至2017年6月于湖北省荊州市松滋市中醫院手術切除且經病理證實的70 例卵巢癌組織標本及相應癌旁組織標本（距癌組織＞5 cm，經HE 染色顯示無癌細胞浸潤），所有癌組織標本均經病理證實為卵巢癌。患者平均年齡（56.63±7.42）歲，＜60 歲28 例，≥60 歲42 例；臨床分期：Ⅰ期17 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期18 例，Ⅳ期13 例；腫瘤直徑：≤5 cm 27例，＞5 cm 43 例；組織學類型：漿液性37 例，其他33 例；分化程度：高分化14 例，中分化15 例，低分化41 例；有淋巴結轉移43 例，無淋巴結轉移27 例。

納入標準： ①患者在術前均未經放化療或其他治療，且無手術禁忌；②患者經病理診斷證實為卵巢癌[7]；③患者及其家屬對本研究知情同意，并簽訂協議書。排除標準：①患有肝病、高血壓、心臟病等疾病者；②資料不完整，無法進行術后隨訪者。另收集患者腫瘤直徑、組織學類型、臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移等臨床病理資料。本研究經湖北省荊州市松滋市中醫院道德倫理委員會批準通過，符合《赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑

SP 免疫組化試劑盒及DAB 顯色試劑盒，購自武漢博士德公司；山羊抗人AIF 多克隆抗體，購自Santa Cruz 公司；兔抗人PARP1 多克隆抗體，購自美國CST公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學法檢測組織標本中PARP1、AIF蛋白表達 采用免疫組織化學法檢測各組織標本中PARP1、AIF 蛋白表達，具體操作如下。

①各組織標本經固定、石蠟包埋后，石蠟切片機切片，厚度約4 μm。②展片，60℃烘烤1 h。③常規二甲苯脫蠟，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇水化。④枸櫞酸鈉緩沖液煮沸18 min 進行抗原熱修復。⑤滴加3%過氧化氫于室溫孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶。⑥磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）沖洗3 min×3 次，滴加1%牛血清白蛋白，孵育30 min 封閉非特異性結合位點。⑦而后吸棄封閉液（陰性對照除外），分別滴加山羊抗人AIF 多克隆抗體、兔抗人PARP1 多克隆抗體，置于4℃冰箱過夜。⑧取出切片，PBS 沖洗5 min×3 次，加入生物素標記的二抗，室溫孵育40 min。⑨PBS 沖洗切片5 min×3次，DAB 顯色，10%蘇木精復染。⑩70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.3.2 結果判定 由三名病理醫生對每張染色片進行評分取均值，以細胞漿或細胞膜呈棕黃色顆粒為陽性顯色。根據染色強度和陽性細胞百分比來進行評分。

①細胞染色強度評分標準：0 分（無染色），1 分（淺黃色），2 分（棕黃色），3 分（棕褐色）。②陽性細胞百分比評分標準： 陽性細胞數＜10%，記0 分；10%～25%，記1 分；26%～50%，記2 分；51%～80%，記3 分；＞80%，記4 分。染色指數（staining index，SI），即染色強度與陽性細胞百分比評分乘積。SI＜3 分，陰性（-）；SI=3 分，弱陽性（+）；3 分＜SI＜6 分，中等陽性（++）；SI≥6 分，強陽性（+++）。其中陰性和弱陽性表示低表達，中等陽性和強陽性表示高表達。

1.3.3 隨訪 所有患者均有完整的隨訪資料，隨訪時間36 個月，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止日期，無病生存期（disease-free survival，DFS）的計算為從手術日期至疾病復發或因疾病進展導致患者死亡的時間。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t 檢驗；計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗；采用Spearman 分析卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達相關性采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，行Log-rank 檢驗； 采用Cox比例風險模型分析影響卵巢癌患者預后的危險因素，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 卵巢癌組織和癌旁組織中PARP1、AIF 表達情況的比較

卵巢癌組織中PARP1、AIF 陽性表達率分別為72.86%（51/70）和70.00%（49/70），均高于癌旁組織，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 卵巢癌組織和癌旁組織中PARP1、AIF 表達情況的比較[n（%）]

2.2 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達與患者臨床病理指標的關系

PARP1、AIF 在卵巢癌組織中的表達與患者年齡、腫瘤直徑、組織學類型無相關性（P＞0.05）。PARP1、AIF 高表達患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴結轉移比例均高于低表達患者，差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

表2 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達與患者臨床病理指標的關系[n（%）]

2.3 卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達的相關性

卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達呈正相關（r=0.791，P＜0.05）（表3）。

表3 卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達的相關性（n）

2.4 卵巢癌組織中PARP1、AIF 表達與患者術后DFS 的關系

PARP1 高表達卵巢癌患者中位DFS 為6.78 個月，短于PARP1 低表達患者的23.32 個月，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖1）。AIF 高表達卵巢癌患者中位DFS 為7.80 個月，短于AIF 低表達患者的28.00 個月，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

圖1 卵巢癌組織中PARP1 表達與患者術后DFS 的關系

圖2 卵巢癌組織中AIF 表達與患者術后DFS 的關系

2.5 影響卵巢癌患者預后的危險因素

單因素分析顯示，PARP1、AIF、臨床分期、分化程度及有無淋巴結轉移均是影響卵巢癌患者預后的危險因素（P＜0.05）。多因素Cox 分析顯示，臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移、PARP1 及AIF 均是影響卵巢癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）（表4）。

表4 影響卵巢癌患者預后的危險因素

3 討論

手術切除病灶是目前卵巢癌的主要治療手段，輔以放化療或放療，但治療效果有限[8-9]。因此尋找具有診斷、 預后預測潛力的標志物及新治療靶點成為現階段的研究熱點。PARP1 是具有多聚二磷腺苷酸核糖基催化活性的蛋白酶，存在于多數真核細胞內，在DNA 損傷修復、細胞周期、基因組穩定和細胞死亡等方面均發揮重要作用[10-12]。PARP1 在卵巢癌中的呈現高表達，能促進卵巢癌的生長及淋巴結轉移[13-14]。本研究結果顯示，卵巢癌組織中PARP1 陽性表達率高于癌旁組織，PARP1 高表達患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化及有淋巴結轉移比例均高于低表達患者（P＜0.05），與張燦燦等[14]研究相似，提示PARP1 在卵巢癌組織中存在異常高表達，可能參與卵巢癌的發生及發展。

細胞凋亡是一系列酶參與的生化反應，在維持正常細胞更新和異常細胞清除平衡中起著重要作用，受許多凋亡相關因子的影響[6，15]。AIF 是具有促凋亡活性的蛋白，又具有氧化還原酶活性，在腫瘤細胞中呈現高表達，對細胞凋亡起促進作用[5，16]。陳吉等[17]研究報道，胃黏膜組織中AIF mRNA 高表達與胃癌形成有一定關聯，可作為早期評估胃癌的臨床指標。本研究結果顯示，卵巢癌組織中AIF 陽性表達率高于癌旁組織，AIF 高表達患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、 低分化及有淋巴結轉移比例均高于低表達患者（P＜0.05），與陳吉等[17]研究結果相似，提示AIF 能夠為腫瘤細胞生長活動提供能量，促進腫瘤細胞增殖、生長，提示AIF 在卵巢癌發生發展中發揮一定作用。

DFS 是在根治性手術后作為輔助化療時最常用的終點指標，本研究Kapalan-Meier 生存曲線分析結果顯示，PARP1 和AIF 高表達卵巢癌患者中位DFS均短于低表達患者（P＜0.05），表明PARP1 和AIF 可能作為卵巢癌的預后指標，其高表達提示患者預后較差。進一步采用Cox 模型分析結果顯示，臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移、PARP1 及AIF 均是影響卵巢癌患者預后的危險因素（P＜0.05），而PARP1、AIF、臨床分期及分化程度是影響卵巢癌患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），提示PARP1 和AIF 可能作為判斷卵巢癌患者預后的參照指標。同時需關注卵巢癌的臨床分期、分化程度對患者預后的影響。此外，本研究結果顯示卵巢癌組織中PARP1 與AIF 表達呈正相關（P＜0.05），由此也提示PARP1、AIF 在卵巢癌發生發展中可能協同發揮作用進而影響腫瘤細胞生物學過程，但具體機制尚需深入探究[15-16]。

綜上所述，PARP1、AIF 在卵巢癌組織中陽性表達率高于癌旁組織，其與卵巢癌患者臨床分期、分化程度、有無淋巴結轉移及DFS 相關，可能作為評定卵巢癌患者預后的臨床參考指標。但由于目前研究的局限性，PARP1、AIF 參與卵巢癌發生發展的具體作用機制有待進一步研究。