川蛭通絡(luò)膠囊對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

楊海燕 李彥 孔詠梅

腦卒中主要由腦血管出血或阻塞導(dǎo)致，其中因血管栓塞導(dǎo)致的缺血性腦卒中尤為常見，約占80%[1]。世界范圍內(nèi)，腦卒中已成為人類僅次于心腦血管和癌癥的第三大死因，也是成人致殘的主要原因[2,3]。臨床缺血性腦損傷治療的原則之一是盡早恢復(fù)血液再灌注，溶栓治療是惟一推薦用于治療腦缺血的治療方法，然而，其受到治療窗窄和高出血風(fēng)險(xiǎn)并發(fā)癥的限制[4]。研究表明，缺血性腦損傷的機(jī)制不僅僅局限于腦組織本身的缺血缺氧性損害，而且還在于缺血后產(chǎn)生的一系列的級(jí)聯(lián)式反應(yīng)，比如炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、凋亡反應(yīng)及細(xì)胞修復(fù)能力減弱等[5,6]。同時(shí)，腦缺血后再灌注也會(huì)造成腦損傷，導(dǎo)致腦水腫、腦出血和神經(jīng)元死亡，這種現(xiàn)象被稱為腦缺血/再灌注損傷。川蛭通絡(luò)膠囊(CZTLC)經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，用于中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)(腦梗死)恢復(fù)期血瘀氣虛證，癥見：半身不遂，言語澀或不語，偏身麻木，口舌歪斜，神倦乏力，舌質(zhì)暗，或有瘀斑、瘀點(diǎn)，舌下青筋顯露，脈沉細(xì)、細(xì)澀或細(xì)弦，苔薄白。復(fù)方中藥CZTLC由水蛭、川芎、丹參、黃芪4味藥組成，以補(bǔ)陽還五湯為依據(jù)研發(fā)而成[7]。活血化瘀為中醫(yī)治療的根本方法，氣血同治、以氣行血的觀點(diǎn)使得CZTLC在腦梗死恢復(fù)期的治療中有效[8,9]。Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，該藥在中風(fēng)病綜合療效、神經(jīng)功能缺損評(píng)分及中醫(yī)癥候療效等方便效果顯著。然而，目前對(duì)川蛭通絡(luò)膠囊的生物學(xué)效應(yīng)背后的具體機(jī)制還沒有完全了解。因此本研究采用小鼠建立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)進(jìn)行缺血性腦損傷研究，進(jìn)而探索CZTLC 對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10 周齡健康雄性ICR小鼠，SPF級(jí)，體重20～25 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)2018 0008]。小鼠飼養(yǎng)于魯南制藥集團(tuán)股份有限公司新藥安評(píng)中心，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h 光照/黑暗交替，溫度(25±1)℃，濕度(65±5)%。

1.2 藥品與試劑 川蛭通絡(luò)膠囊(魯南厚普制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20090031)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)、TTC 染色試劑盒試劑盒購于南京建成生物工程研究所；小鼠白介素-4(IL-4)、IL-10、TNF-α及IL-1β ELISA試劑盒購自R&D Systems；Bax、Bcl-2及Caspase-3一抗購于abcam。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組及給藥:隨機(jī)將小鼠分為假手術(shù)(sham)組、腦缺血再灌注損傷(MCAO/R)組、川蛭通絡(luò)膠囊治療(CZTLC)組，每組15只，其中CZTLC的劑量依據(jù)臨床用藥劑量換算小鼠給藥劑量為0.06 g/kg，建模之前連續(xù) 5 d口服灌胃給藥，3次/d。

1.3.2 MCAO/R模型建立:參照 Memezawa等[10]的方法，采用0.7%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，將小鼠仰臥位，常規(guī)頸部皮膚消毒、去毛及切皮，暴露左側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈，距頸總動(dòng)脈分叉處約0.5 cm于頸外動(dòng)脈剪一小缺口，線拴由頸外動(dòng)脈進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈至大腦中動(dòng)脈，深度距離頸總動(dòng)脈分叉處約 1 cm 時(shí)感有阻力時(shí)停止進(jìn)線，結(jié)扎頸外動(dòng)脈缺口及縫合皮膚并至于 37℃ 恒溫室內(nèi)，缺血 1 h 后抽出線拴進(jìn)行腦組織再灌注。操作全部完成后，將小鼠放置37℃ 恒溫室內(nèi)單籠飼養(yǎng)。其中對(duì)照組僅將頸外動(dòng)脈剪一小切口并結(jié)扎。

1.4 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 小鼠再灌注 24 h 后，對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，依據(jù)Wang等[11]將神經(jīng)功能缺損程度分為 5 個(gè)等級(jí)：0 分：正常，無神經(jīng)功能喪失；1分：對(duì)側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時(shí)，小鼠向?qū)?cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時(shí)身體向?qū)?cè)(癱瘓側(cè))傾倒，中度神經(jīng)功能缺損；4分：不能行走，意識(shí)水平低下或動(dòng)物死亡。

1.5 小鼠腦梗死面積的分析 神經(jīng)功能評(píng)估后，處死小鼠，取腦組織進(jìn)行TTC染色[12,13]。將腦切成2～3 mm厚的連續(xù)冠狀切片，放置配好的TTC染液中，37℃染色15 min，取出，用水沖洗，并拍照記錄。正常腦組織染色為紅色，梗死組織未染色(白色)。用 ImageJ 軟件處理圖像，以乘積法計(jì)算 IS 范圍，并以每個(gè)腦片重量進(jìn)行校正[14]。腦梗死面積比以 IS 占留取腦組織質(zhì)量百分比表示。

1.6 HE、甲苯胺藍(lán)染色 小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉，處死取出腦組織，快速放到10%中性緩沖甲醛溶液(湖南爾康制藥股份有限公司，H43020198)，固定48 h。隨后在梯度乙醇中脫水，石蠟包埋，手輪式切片機(jī)將腦組織切成3～5 μm，用于HE、甲苯胺藍(lán)染色，顯微鏡下對(duì)各組腦組織的病理形態(tài)、神經(jīng)元損傷程度進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.7 炎性因子、SOD及MDA含量檢測 分別以化學(xué)比色法測定腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量；ELISA 法測定腦組織中L-4、IL-10、TNF-α及IL-1β表達(dá)水平，均按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.8 RT-PCR及Western Blot檢測Bax、Bcl-2及Caspase-3基因及蛋白表達(dá)水平 TRIzol試劑提取腦組織中總RNA，各組取等量RNA通過cDNA試劑盒試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過PCR擴(kuò)增Caspase-3、Bax、Bcl-2及GAPDH的cDNA。擴(kuò)增的cDNA用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，電泳凝膠成像分析系統(tǒng)觀察。利用Image J analyzer軟件對(duì)各條帶的凝膠圖譜進(jìn)行定量。在蛋白提取前，先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稱重，每100 mg組織中加入1 ml RIPA、1 0 μl PMSF，組織勻漿，低溫離心機(jī)(12 000 r/min)離心15 min。提取的蛋白上清液與上樣緩沖液按照4∶1體積混合后在沸水中煮5 min，至蛋白變性。蛋白上樣，電泳至溴酚藍(lán)條帶到凝膠的下方，至指示蛋白分子量的Marker條帶全部顯出。電泳結(jié)束后，把凝膠移到PVDF膜上。上述操作完成后，把PVDF膜轉(zhuǎn)移到含5%脫脂奶粉封閉液的平皿內(nèi)，孵育2 h，隨后加一抗4℃孵育過夜。然后用TBST振蕩洗滌3次×8 min，室溫下與二抗共同孵育1 h，再使用TBST振蕩洗滌3次×8 min，其后在PVDF膜上滴加顯色劑，進(jìn)行顯色照相。最后用quantity one軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 川蛭通絡(luò)膠囊對(duì)小鼠MCAO/R腦損傷后的神經(jīng)行為學(xué)表現(xiàn)及梗死面積的影響 手術(shù)當(dāng)天定義為第0天，-120 h開始口服灌胃給藥，連續(xù)給藥5 d，給藥3次/d，手術(shù)后24 h對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，后對(duì)動(dòng)物安樂死取腦組織，進(jìn)行后檢測。MCAO/R組、CZTL組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、小鼠腦梗死面積高于Sham組，CZTL組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死面積低于MCAO/R組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、2，表1、2。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程

圖2 3組腦梗死面積

表1 3組小鼠腦缺血再灌注24 h后的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較 n=15,分,

表2 3組小鼠腦梗死面積比較

2.2 3組小鼠腦組織皮層和海馬CA1區(qū)組織病理學(xué)觀察 HE染色、尼氏染色顯示，與Sham組比較，MCAO/R可明顯誘導(dǎo)左側(cè)皮層和海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷(P>0.05)。MCAO/R組大鼠腦組織損傷側(cè)主要表現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞體積縮小，胞漿空泡變性，細(xì)胞間排列疏松，海馬、皮質(zhì)的神經(jīng)元大部分萎縮；細(xì)胞內(nèi)尼氏小體數(shù)量減少，染色變淺。與MCAO/R組比較，觀察到CZTLC組小鼠腦組織區(qū)域神經(jīng)元細(xì)胞損傷較輕微，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞的緊密排列和細(xì)胞內(nèi)尼氏小體數(shù)量增加。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與Sham組相比，藥物處理組海馬CA1和皮層的正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。綜上，川蛭通絡(luò)膠囊顯著減輕了皮層及海馬CA1神經(jīng)元的損傷。見圖3。

圖3 川蛭通絡(luò)膠囊對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠皮層及海馬CA1區(qū)病理組織學(xué)改變的影響(HE、甲苯胺藍(lán) × 400)

2.3 川蛭通絡(luò)膠囊對(duì)小鼠腦組織SOD活性及MDA含量的影響 Sham組小鼠腦組織SOD活性明顯高于MCAO/R組，MDA水平明顯低于MCAO/R組(P<0.05)；與MCAO/R組相比，CZTLC組小鼠腦組織中SOD活性顯著升高，MDA水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組小鼠腦組織SOD活性及MDA水平

2.4 川蛭通絡(luò)膠囊對(duì)腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-10表達(dá)的影響 MCAO/R組小鼠腦勻漿 TNF-α、IL-1β及IL-6含量較Sham組明顯升高，而 IL-10 含量明顯降低(P<0.05)。CZTLC組小鼠腦勻漿TNF-α、IL-1β 及IL-6含量較MCAO/R組明顯降低，而 IL-10 含量明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 3組小鼠血清炎性因子水平比較

2.5 川蛭通絡(luò)膠囊可明顯抑制小鼠腦組織細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及蛋白的表達(dá) CZTLC可顯著下調(diào)凋亡蛋白 caspase-3 及 Bax 在基因水平及蛋白水平的表達(dá)，同時(shí)其亦明顯上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，與CAMO/R組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5，圖4。

圖4 小鼠腦組織中Bax,Bcl-2,Caspase-3 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況

表5 3組小鼠caspase-3、Bax及Bcl-2基因表達(dá)情況

3 討論

本研究中，我們提前給予小鼠CZTLC進(jìn)行干預(yù)，后手術(shù)栓塞頸部中動(dòng)脈1 h，再灌注24 h 造成小鼠腦組織損傷，探討CZTLC是否具有神經(jīng)保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。CZTLC是中國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的著名中藥，臨床使用已有10多年。從實(shí)驗(yàn)研究中了解CZTLC的生物學(xué)機(jī)制，有助于開發(fā)CZTLC治療腦缺血的潛在臨床應(yīng)用。本研究表明，CZTLC可以保護(hù)小鼠大腦免受腦缺血-再灌注損傷，包括減少神經(jīng)功能缺損和腦梗死面積、抑制炎性反應(yīng)及抗氧化應(yīng)激。通過HE、甲苯胺藍(lán)染色，我們發(fā)現(xiàn)CZTLC抑制腦細(xì)胞壞死，改善大腦皮層及海馬神經(jīng)元形態(tài)，亦從基因和蛋白水平證實(shí)CZTLC可以抑制腦細(xì)胞凋亡。

腦缺血和再灌注均可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[15]。神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積是評(píng)價(jià)模型成功和藥物有效性的直接簡便的觀察方法。本研究結(jié)果顯示，CZTLC可明顯改善MCAO/R神經(jīng)行為學(xué)和腦組織的壞死。

研究發(fā)現(xiàn)，炎癥參與腦缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程，其中TNF-α和IL-1β是炎癥的兩個(gè)重要因子，參與血腦屏障的通透性和促進(jìn)部分炎性介質(zhì)表達(dá)[16,17]。IL-10是一種抗炎因子，通過抑制白細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-1、TNF-α等細(xì)胞因子，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用[18]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，CZTLC處理組IL-10的表達(dá)量顯著升高，而IL-1β、TNF-α及IL-6水平模型組明顯高于藥物處理組。

在正常生理?xiàng)l件下，體內(nèi)生成的活性氧(reactive oxygen species,ROS)在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的催化作用下還原為過氧化氫，在谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和過氧化氫酶的作用下進(jìn)一步還原為無害的水和氧氣，從而維持體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡[19]。在腦缺血再灌注時(shí)產(chǎn)生大量氧自由基，同時(shí)SOD活性降低，清除氧自由基的能力減弱[20]，而脂質(zhì)過氧化物MDA含量明顯升高[21]，組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致氧化與抗氧化平衡失調(diào)、ROS增加，從而導(dǎo)致腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成腦組織損傷。本實(shí)驗(yàn)中模型小鼠腦內(nèi)存在氧化應(yīng)激損傷，CZTLC提前干預(yù)組小鼠腦組織SOD活性顯著增加，MDA含量顯著降低，提示CZTLC能明顯降低模型組小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激損傷。

腦組織持續(xù)存在缺血缺氧損傷會(huì)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，這是腦梗死程度進(jìn)一步加重的主要機(jī)制之一[22]。神經(jīng)元缺血缺氧后可激活Bax及caspase-3蛋白，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[23-25]。本研究結(jié)果顯示，CZTLC預(yù)處理組，小鼠腦組織Bax,Baxcaspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2水平明顯升高。

綜上所述，CZTLC能夠通過改善腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)行為學(xué)及減輕腦梗死面積，并能進(jìn)一步通過抗氧化應(yīng)激、抑制炎性反應(yīng)及抗細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕缺血性損傷的作用，但其具體機(jī)制及療效還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。