腫瘤標記物microRNA-21在胰腺癌中的表達及意義

馮志林 李紫宣 崔大鵬 孔令霞 趙茜

惡性腫瘤發生因素多種多樣，大致可分為外源性因素和內源性因素兩種。其中，起源于上皮組織的惡性腫瘤統稱為癌，如胰腺癌(PC)便是其中一種常見類型。PC惡性程度很高，5年生存率<1.00%，治愈率極低。結合當前PC的流行病學與臨床研究結果，其發病率和死亡率上升明顯，男性高于女性，二者之比為(1.5～2)∶1[1]。研究發現，雖然男性PC患者較女性PC患者比例更高，但絕經后的女性PC患者占比卻與男性相仿[1]。核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)作為一種常見的遺傳信息載體，誘導蛋白質合成是其主要使命，它不僅廣泛存在于健康生物細胞中，同時在部分病毒、類病毒中也可尋見其蹤影。而MicroRNAs(miRNAs)作為靶基因相關信號通路調控者，主要由一類長18～27個核苷酸的單鏈RNA分子構成，有較好的抑癌基因或癌基因功能。而miR-21作為miRNAs之一，在胃、肺、肝、食管等[2]器官或組織的多種癌癥中均處于高表達狀態，故而成為一種新型腫瘤標志物，其異常表達與癌的發生發展、轉歸等過程息息相關。本文將通過對照試驗的方式對PC患者循環miR-21表達水平現代實驗檢測，探析其表達及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 對象納入時間為2017年1月至2019年1月，共53例PC患者，就診科室為腫瘤科。PC患者全部由病理切片明確診斷，納入與排除標準均符合《胰腺癌綜合診治指南(2018年版)》[4]相關要求，且通過本院倫理委員會審核后執行。性別：男37例，女16例；年齡52～80歲，平均年齡(64.23±5.28)歲。按美國癌癥聯合會(Alternate Joint Communications Center，AJCC)制定的TNM及病理分期系統(第7版)評估：T1/2期15例，T3/4期38例；淋巴結轉移：N0/1者：19例，N2/3者34例；病理分型：有淋巴結轉移8例，無淋巴結轉移45例。簽署《知情同意書》和各項基礎資料全部有效，課題均符合《赫爾辛基宣言》(世界醫學會)中的醫學研究倫理原則。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑：儀器操作步驟及注意事項，試劑的操作規范、步驟及注意事項等均按具體使用說明書或根據檢測師實際需求而定。儀器：微量冷凍離心機(4℃)Centrifuge 5415R Eppendorf公司；顯微鏡成像系統 ECLIPSE 51i 日本尼康公司；電熱恒溫水浴箱 HHW 21Cu 600 中國南通科學儀器廠；100 mm細胞培養皿 Coring公司；流式細胞分選儀 Facs-AriaI Beton Dickinson公司；PCR儀 TAKARA 上海皓嘉科技儀器制造有限公司；恒溫磁力攪拌機 78HW-1型 杭州儀表電機廠；超凈工作臺 YG-875B型 蘇州醫療設備廠；酶標儀 Model 550型 BIO/RAD公司；酸度計 3505型 英國JENWAY公司。試劑：RNA提取試劑盒 北京天恩澤基因科技有限公司；RIPA細胞裂解液 碧云天公司；細胞核蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒 碧云天公司；型兔抗人SPRY-2多克隆抗體 美國Proteintech公司；RT-PCR試劑盒 TransGen Biotech公司；胰蛋白酶、鏈霉素等 美國Sigma Chemical公司；腫瘤細胞分離提取試劑盒(DPI、LPS)Panomics公司；型兔抗人AEG-1多克隆抗體 美國Proteintech公司；胎牛血清 Hyclone公司；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)吉諾公司；普通質粒答大提試劑盒 TIANGEN公司；總RNA提取盒 BD Bioscience公司；Human MiR-21 mimics、inhibitor RiboBio公司；Human MiR-21 vector、shRNA OriGene公司。

1.2.2 實驗方法：將PC組術中切除的腫瘤組織按腫瘤細胞分離提純試劑盒具體使用說明書剪切成小塊并置入實驗容器，加入5 ml組織細胞消化液將其制成細胞懸液，將細胞懸液輕輕滴在事先加入了5 ml分離液(分離管)上層，在37℃條件下放置(垂直)120 min后吸出上層懸液并離心處理(離心速率：2 200 r/min，離心時間8 min，離心環境溫度4℃)下層分離液，重復此步驟(≥2次)直至得到提純腫瘤細胞。將原代腫瘤細胞和AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、CFPAC-1等胰腺癌細胞株配制成濃度為2×106/ml的待培養液，并將上述細胞株置入洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute，RPMI)研發的RPMI-1640培養液(含硫酸鏈霉素100 mg/ml，青霉素 100 U/ml，胎牛血清10%)中培養，培養環境溫度：37℃，培養箱濃度：5%二氧化碳(CO2)。

1.2.3 癌組織與癌旁組織的RNA提取：從凍存處取出癌及癌旁組織并切取100 mg后，用PBS沖洗液(1%)沖洗后放入無RNA酶的試管(5 ml)中，接著加入TRIZOL提取劑(5 ml)并進行高速勻漿處理，直至團塊消失。然后將其轉移至EP試管(1.5 ml)后加入氯仿(200 μl)反復顛倒(40次左右)直至混勻再進行離心(離心速率：12 000 G/min，離心時間：15 min，離心環境溫度：4℃)處理。轉移上清至EP試管(1.5 ml)后加入550 μl異丙醇混勻并靜置5 min，離心(離心速率：12 000 G/min，離心時間：15 min，離心環境溫度：4℃)處理，并去上清(共分a、b、c等三步)。接著定量并將RNA濃度調至0.5 μg/μl。采用紫外分光光度儀檢測并讀取RNA的光密度(optical density，OD)值，將RNA反轉錄成cDNA(步驟按陳劍[5]執行)并計算此步驟中反應結束后各反應管的Ct值(重復實驗條件：復孔間的Ct值之差>1)。見表1。

表1 棄去上清步驟

1.2.4 QR-PCR檢測：取3個EP管(0.2 ml)并分別標記成以下三種應標本號：β-肌動蛋白(β-actin)、SPRY-2、AEG-1，β-actin為內參。接著將RNA逆轉錄成cDNA，步驟共2步。第一步反應體系的反轉錄儀的運行條件為70℃，反轉錄時間5 min，保存條件4℃。第一步結束后接著進行第二步逆轉錄反應，即將40 μl體系中前5中反應物震蕩混勻和離心(離心1 000 g，1 min)處理放置于冰上設置反轉錄儀條件(37℃條件下60 min，95℃條件下5 min)，4℃條件下恒定時將EP管置于反轉錄儀上進行反轉錄反應。Spry2、AEG-1的QR-PCR反應：均在96孔板中進行PCR擴增。反應結束后在此計算各反應管的Ct值(重復實驗條件與上述相同)。見表2、3。

表2 RNA逆轉錄成cDNA步驟

表3 引物序列

1.2.5 結果判斷：病理圖像分析均由≥2名經驗豐富的病理科醫師評估，分析PC患者機體中的miR-21、SPRY-2、AEG-1在癌組織和癌旁組織中的表達，陽性細胞數平均百分比：該切片陽性細胞百分比(Percentage of positive cells，PPC)，共4個等級：0≤PPC(0分)≤5%，6%≤PPC(1分)≤25%，26%≤PPC(2分)≤50%，51%≤PPC(3分)≤75%，PPC(4分)>75%，觀察視野范圍：每張切片隨機觀察5個中倍視野(*200)，每個視野計數100個細胞；根據染色強弱分4個等級：無染色=0分，弱染色=1分，中等強度染色=2分，強染色=3分，積分方式為二者相加：陰性(-)<2分，2分<弱陽性(+)≤3分，4分≤陽性(++)≤5分，6分≤強陽性(+++)≤7分。QR-PCR中的miR-21表達量采用N=2-△Ct*10 000表示，配對的正常組織變換倍數采用N=2-△△C表示(腫瘤組織miRNA表達)，△Ct、△△Ct計算公式：

△△Ct=(CtmiR-21-Ctβ-catein)腫瘤-CtmiR-21-Ctβ-catein)癌旁組織

△Ct=CtmiR-21-Ctβ-catein

1.3 統計學分析 應用SPSS 21.0統計軟件，組間配對時的T、P檢驗采用PRISM6.0軟件處理，雙變量相關采用Spearman檢驗，兩個相關樣本、獨立樣本分別采用Wilcoxon檢驗、Mann-Whitney U檢驗，PC患者癌組織中的相對表達量為非正常分布，癌旁組織中參數表達則用非參數分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組患兒臨床有效率比較 通過QR-PCR儀繪制的熔解與擴增曲線來看，PC患者癌組織(浸潤、轉移癌組織及不典型增生組織)的miR-21表達水平顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4，圖1。

圖1 miR-21和β-actin的熔解和擴增曲線

表4 不同癌變組織與癌旁組織中的miR-21表達

2.2 miR-21在PC細胞株中的表達及轉染pre-miR-21/inhibitor對miR-21表達的影響 經QR-PCR法檢測結果來看，PC患者細胞株AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、CFPAC-1中的miR-21表達水平均處于異常增高，且以AsPC-1表達最高，較正常胰腺導管上皮細胞更高(P<0.05)，提示PC患者癌細胞中的miR-21呈高表達。將上述表達水平最高的AsPC-1進行轉染(48 h)實驗后再次用QR-PCR法檢測后發現，pre-miR-21轉染組的miR-21表達顯著高于anti-miR-21對照組，miR-21 injibotor轉染組的miR-21表達缺顯著低于anti-miR-NC對照組(P<0.05)。見表5。

表5 miR-21在PC細胞株中的表達及轉染pre-miR-21/inhibitor對miR-21表達

2.3 miR-21表達對PC細胞增殖的影響 經Cell Counting Kit-8 細胞計數試劑(CCK-8)法檢測發現，PANC-1細胞增殖能力上調與miR-21表達上調呈正比(P<0.05)，同理MIAPaCa-2細胞的增殖能力下降時，miR-21表達也隨之下調(P<0.05)，提示PC癌細胞的增殖能力受miR-21的調控。見圖2。

圖2 miR-21表達與PC細胞增殖的關系

2.4 抑制NADPH氧化酶減弱PC細胞轉移能力 原代細胞DPI培養(12 h)檢測發現，原發性PC的侵襲能力受DPI的抑制效果與藥物濃度呈正比(P<0.05)，PC腫瘤細胞轉移能力受DPI的抑制效果與藥物治療同樣呈正比(P<0.05)。通過圖3檢測及DPI給藥結果均證實，DPI給藥可明顯的降低PC患者原代腫瘤細胞內的活化氧簇(Reactive oxygen species，ROS)表達能力(P<0.05)；而為降低PC原代腫瘤細胞的侵襲能力，本文還進行了阻斷實驗。結果發現，利用Mito-TEMP 0(ROS清除劑)阻斷后的四甲基哌啶(ROS的類似物)表達顯著下降(P<0.05)。見圖3、4。

圖3 DPI對PC腫瘤細胞的侵襲能力抑制劑藥物濃度關系

2.5 MiR-21與SPRY-2和AEG-1 mRNA關系 經Person相關系數檢測發現，SPRY-2和AEG-1 mRNA表達與miR-21之間的相關系數分別為-0.375和-0.365，P=0.033、0.041，提示PC癌組織中的miR-21與SPRY-2和AEG-1 mRNA表達呈負相關(P<0.05)。見圖5。

圖4 DPI給藥下的ROS表達及阻斷表達

圖5 MiR-21與SPRY-2和AEG-1 mRNA關系散點圖

2.6 經Spearman秩相關分析表明，PC患者癌組織中的SPRY-2蛋白表達與miR-21呈負相關(P<0.05)，而AEG-1蛋白表達與miR-21無相關性(P>0.05)。見表6。

表6 PC癌組織中的SPRY-2、AEG-1蛋白表達與miR-21的Spearman秩相關

3 討論

通常而言，miR-21是高度保守的。作為一種現代醫學(動物實驗、臨床試驗)研究最多的microRNA(非編碼小分子RNA)之一，其參與細胞病變的過程主要是對靶基因mRNA翻譯調節靶基因的表達進行降解與抑制，這就是它對機體生物學進程進行有影響的關鍵。越來越多的研究[5,6]證實，miR-21在各種腫瘤的增殖、轉移、預后等過程均關系密切，且多呈高表達狀態，當然也包括PC人群。據統計，PC的發病率、病亡率依舊處在增高態勢，歐美國家近30年來PC發病率、病死率位居腫瘤發病率和惡性腫瘤病死率的第10、4位，而國內分別位居第7、4位，是世界范圍內病死率極高的一種重要惡性腫瘤，預計在2030年左右可能成為癌癥相關死亡的第二大常見、多發原因[6]。miRNA-RISC對靶基因的mRNA的作用主要有三種，第一種是對mRNA分子進行切斷，第二種是對靶基因的翻譯進行抑制，第三種是結合抑制，而上述三種方式作用的好壞，主要取決于miRNA-RISC與靶基因轉錄體序列互補的程度。故研究miR-21與PC的關系，是有望成為該病及相關并發癥診斷與治療的靶點之一的。

細胞的癌基因和抑癌基因表達異常，是導致癌癥的關鍵因素。從目前掌握的流行病學相關研究來看，miR-21在各種癌癥及腫瘤中均有參與，如前列腺癌、非小細胞肺癌、膠質母細胞瘤等，當然在PC中也有與miR-21相關的各種研究報道。既往研究發現，PC組織中呈高表達的不僅是miR-21，還有miR-222、miR-211、miR-155等[7]。17q23染色體FR17B的脆性區域是miR-21的定位范圍，極易發生斷裂與缺失，高保守性和具有組織轉錄單位是其主要特征。故當機體細胞組織中的的癌基因和抑癌基因表達異常時，miR-21常呈現出高表達狀態，即表達失調。本文通過QR-PCR法檢測發現，miR-21在53例PC患者的癌組織與癌旁組織中異常，且癌組織的miR-21表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，而結合既往相關的分子生物學研究來看，miR-21在PC發生發展、預后等過程中均發揮了重要作用，因此探析其與PC癌基因與抑癌基因的分子機制舉足輕重。AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、CFPAC-1、HPAC、HPAF-Ⅱ、Hs766T、MIA Paca-2、PANC-1、SU.86.86等是幾種常見的PC細胞，功能各不相同，表達各異。通過QR-PCR法檢測發現，PC患者的AsPC-1、BxPC-3、Capan-1、Capan-2、CFPAC-1細胞中的miR-21表達水平均處于異常增高狀態，其中最高的是AsPC-1表達，較正常胰腺導管上皮細胞更高(P<0.05)，AsPC-1主要來源于胰頭癌原發腫瘤，分泌黏蛋白和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)，有明顯的轉移傾向。AsPC-1轉染(48 h)后pre-miR-21轉染組miR-21表達高于anti-miR-21對照組，miR-21 injibotor轉染組的miR-21表達低于anti-miR-NC對照組(P<0.05)。CCK-8法檢測下PANC-1細胞增殖能力上調與miR-21表達上調呈正比，MIAPaCa-2細胞的增殖能力下降與miR-21表達下調成正比(P<0.05)，說明PC癌細胞的增殖能力受miR-21的調控。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)是最終電子受體NADP+接受電子后的產物[8]，是產生活性氧的酶家族成員之一，在當前的臨床醫學中業已證明其在多種細胞類型中均有所表達。如有學者研究證實，腫瘤細胞中產生的高水平ROS表達水平不僅與癌癥的進展相關，且與NADPH氧化酶活性關系密切[9]。抑制NADPH氧化酶對腫瘤細胞中的與miR-21表達有較好的調控作用。故本文將53例PC患者腫瘤組織中分離出來的原發細胞進行不同濃度的NOX氧化酶抑制劑(Diphenyleneiodonium Chloride，DPI)培養(12 h)與檢測，結果發現，原發性PC的侵襲能力受DPI的抑制效果與藥物濃度呈正比，PC腫瘤細胞轉移能力受DPI的抑制效果與藥物治療呈正比(P<0.05)。同時DPI給藥后PC患者原代腫瘤細胞內的ROS表達能力顯著降低(P<0.05)，且Mito-TEMP 0(ROS清除劑)阻斷后的四甲基哌啶(ROS的類似物)表達顯著下降(P<0.05)。上述研究均證實，抑制NADPH氧化酶可降低PC患者腫瘤細胞內的miR-21表達。

既往研究證實，SPRY-2在一些腫瘤細胞中呈現出明顯的異常表達，如Xu等[10]證實SPRY-2作為一種新型的受體絡氨酸激酶信號通路的抑制物，在胃癌癌組織中的表達顯著偏低，且與5年生存率呈正比；如Shukla等[11]證實，慢性淋巴性白血病(chronic lymphocytic leukemia，CLL)的細胞組織中的SPRY-2表達依舊顯著下調。AEG-1是常見的一種原癌基因，在多種腫瘤組織中均普遍表達，如余長云等[12]頭頸部鱗狀細胞癌組織中的上皮-間質轉化便受AEG-1介導，參與癌細胞的淺析、轉移；宋恩霖等[13]的子宮頸癌研究同樣證實，AEG-1表達與該病患者的微血管生成關系密切。故本文針對SPRY-2、AEG-1在PC患者癌組織中的表達水平進行了Person相關系數和Spearman秩相關分析，結果發現，PC患者癌組織中的SPRY-2蛋白表達與miR-21呈負相關(P<0.05)，而AEG-1蛋白表達與miR-21之間無相關性(P>0.05)。提示SPRY-2參與了PC患者的miR-21表達調控，這與既往研究中的SPRY-2能逆轉PC癌組織中的MiR-21誘導的細胞增殖和遷移相近[14]。反之，miR-21可通過下調SPRY-2表達來促進PC患者腫瘤細胞的增殖與遷移。而Person相關系數和Spearman秩相關分析發現，AEG-1則不參與miR-21表達調控，故不贅述。

綜上所述，PC患癌組織中的miR-21表達水平呈顯著的高表達狀態，抑制NADPH氧化酶可降低PC患者腫瘤細胞內的miR-21表達。miR-21與SPRY-2呈負相關，可通過下調SPRY-2表達來促進PC患者腫瘤細胞的增殖與遷移?？蓪⑵湟曌鱌C診斷的一種新型標志物。