circMAN2B2對宮頸癌細胞順鉑敏感性的影響

蒙秋 謝興潤 張靜 王海燕 黃守國

化療是中晚期宮頸癌患者重要的治療手段，雖然初期患者對化療反應良好，但隨著宮頸癌細胞對化療藥物的抵抗和耐受的產生，化療耐藥會導致宮頸癌化療失敗[1]。順鉑是宮頸癌的基礎化療藥，對順鉑的化療耐藥是臨床治療中的一個障礙[2]。因此，研究與順鉑類化療抵抗相關的分子機制以提高化療效果具有重要意義。研究表明，circRNA對婦科惡性腫瘤的發生發展具有重要的調控作用，在耐藥性中起著至關重要的作用，可為抗腫瘤藥物耐藥性的研究提供新的靶點，針對其靶向治療有望成為治療宮頸癌的新策略[3,4]。研究報道，敲除circMAN2B2可通過調節miR-1205/S100A8軸抑制神經膠質瘤細胞增殖，侵襲，遷移并減小腫瘤大小[5]。circMAN2B2敲低通過miR-1275/FOXK1軸可顯著抑制H1299和A549肺癌細胞的增殖和侵襲[6]。而circMAN2B2對宮頸癌細胞及順鉑的敏感性的影響尚不清楚。而circRNA可通過調控miRNA影響腫瘤進展，研究顯示，miR-216a-3p在宮頸癌中低表達，高表達可抑制宮頸癌的增殖，集落形成和侵襲[7]。檸檬苦素降低miR-216a甲基化水平，從而增加miR-216a-3p表達并隨后抑制Wnt/β-catenin途徑來減弱乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性[8]，表明miR-216a-3p參與調控宮頸癌細胞的進展，且與癌細胞的藥物耐藥性有關。因此，本實驗旨在研究circMAN2B2對宮頸癌細胞及順鉑的敏感性的影響是否與miR-216a-3p有關。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa細胞(貨號：HZX600，上海滬崢生物科技有限公司)；RPMI-1640完全培養基(貨號：M0201A，上海盈灣生物科技有限公司)；順鉑(貨號：13119-100，艾美捷科技有限公司)；MTT試劑盒(貨號：M1020，上海恒斐生物科技有限公司)；Trizol試劑(貨號：5301100，杭州新景生物試劑開發有限公司)；反轉錄試劑盒(貨號：R1012，廣州東盛生物科技有限公司)；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(貨號：RR420A，武漢科昊佳生物科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號：KA3784，上海群己生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號：AD10-2，上海經科化學科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號：RIPA20110527，上海研謹生物科技有限公司)；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(貨號：701780-480，美國Cayman公司)。

1.2 細胞培養及宮頸癌順鉑耐藥細胞的建立 宮頸癌HeLa細胞用RPMI-1640完全培養基在37℃條件下培養，取對數生長期HeLa細胞，將其分別暴露于不同濃度順鉑梯度的培養基中培養，直至在1 μmol/L順鉑濃度的培養基中正常生長，所得細胞即順鉑耐藥宮頸癌細胞HeLa/DDP。

1.3 細胞分組 取對數生長期細胞HeLa/DDP，將si-NC、si-circMAN2B2轉染至HeLa/DDP細胞中，再用2 μmol/L順鉑處理，記為DDP+si-NC組、DDP+si-circMAN2B2組；將si-circMAN2B2分別與anti-miR-NC、anti-miR-216a-3p轉染至HeLa/DDP細胞中，再用2 μmol/L順鉑處理，記為DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-NC組、DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-216a-3p組。

1.4 MTT檢測細胞增殖抑制率 將HeLa、HeLa/DDP細胞分別用濃度為1、2、4、8、16、32 μmol/L的順鉑處理，培養48 h后按MTT試劑盒說明操作，用酶標儀檢測490 nm處吸光度(OD)值，細胞增殖抑制率=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%。繪制抑制率曲線，計算半數抑制濃度(IC50)。其他各組細胞按上述方法檢測細胞增殖抑制率。

1.5 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circMAN2B2和miR-216a-3p的表達水平 提取總RNA，反轉錄成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。circMAN2B2和miR-216a-3p分別以GAPDH和U6為內參，circMAN2B2上游引物序列：5’-CCCAACATGAGTGAGCCTGT-3’，下游引物序列：5’-GCACCGAGGCATTGAAGAAC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’，下游引物序列：5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’；miR-216a-3p上游引物序列：5’-CACAGTGGTCTCTGGGATTATG-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6 雙熒光素酶報告實驗檢測circMAN2B2和miR-216a-3p的靶向調控 構建circMAN2B2野生型表達載體WT-circMAN2B2和突變型表達載體MUT-circMAN2B2，將其分別與miR-NC和miR-216a-3p共轉染至HeLa細胞中；按照說明書檢測熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circMAN2B2、si-NC、si-circMAN2B2轉染至HeLa細胞中，按1.5中方法檢測miR-216a-3p表達水平。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集1.3中各組細胞，按試劑盒操作進行，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 蛋白質印跡(Western blot)法檢測蛋白表達 提取1.3中各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒定量。蛋白經SDS-PAGE，轉膜，脫脂牛奶封閉，然后用一抗和二抗孵育，暗室曝光顯影，定影，用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參計算蛋白表達水平。

2 結果

2.1 順鉑對宮頸癌HeLa細胞和宮頸癌順鉑耐藥細胞HeLa/DDP增殖抑制率的影響 用不同濃度的順鉑作用HeLa和HeLa/DDP細胞，與HeLa細胞比較，HeLa/DDP細胞增殖抑制率顯著降低，IC50值升高(P<0.05)。見表1。

表1 順鉑對宮頸癌HeLa細胞和宮頸癌順鉑耐藥細胞HeLa/DDP增殖抑制率的影響

2.2 circMAN2B2和miR-216a-3p在HeLa細胞和HeLa/DDP細胞中的表達 與HeLa細胞比較，HeLa/DDP細胞中circMAN2B2表達水平升高，miR-216a-3p表達水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 circMAN2B2和miR-216a-3p在HeLa細胞和HeLa/DDP細胞中的表達

2.3 circMAN2B2靶向調控miR-216a-3p的表達 StarBase預測顯示，circMAN2B2的序列中含有與miR-216a-3p互補的核苷酸序列。WT-circMAN2B2與miR-216a-3p共轉染的細胞熒光素酶活性低于WT-circMAN2B2與miR-NC組共轉染的細胞(P<0.05)，而MUT-circMAN2B2與miR-216a-3p或miR-NC共轉染的細胞熒光素酶活性比較差異無統計學意義(P>0.05)。過表達circMAN2B2，miR-216a-3p表達水平降低(P<0.05)，抑制circMAN2B2表達后miR-216a-3p表達水平升高(P<0.05)。見圖1，表3、4。

表3 雙熒光素酶報告實驗

圖1 circMAN2B2的序列中含有與miR-216a-3p互補的核苷酸序列

2.4 抑制circMAN2B2表達聯合順鉑(2 μmol/L)對HeLa/DDP細胞增殖和凋亡的影響 與DDP+si-NC組比較，DDP+si-circMAN2B2組circMAN2B2表達水平降低，miR-216a-3p表達水平升高，細胞增殖抑制率升高，細胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2，表5。

表4 circMAN2B2調控miR-216a-3p的表達

圖2 抑制circMAN2B2表達聯合順鉑對HeLa/DDP細胞增殖和凋亡的影響;A 增殖、凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表5 抑制circMAN2B2表達聯合順鉑對HeLa/DDP細胞增殖和凋亡的影響

2.5 干擾miR-216a-3p表達逆轉了抑制circMAN2B2表達對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用 與DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-NC組比較，DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-216a-3p組miR-216a-3p表達水平降低，細胞增殖抑制率降低，細胞凋亡率降低，Ki-67、Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3，表6。

圖3 干擾miR-216a-3p表達逆轉了抑制circMAN2B2表達對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用;A 增殖、凋亡相關蛋白表達；B 細胞凋亡流式圖

表6 干擾miR-216a-3p表達逆轉了抑制circMAN2B2表達對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用

3 討論

宮頸癌對放化療不敏感是造成患者復發轉移、預后差的重要原因，因此研究宮頸癌化療敏感性的相關機制，對克服宮頸癌患者的化療耐藥以及延長患者生存期具有重要意義[9,10]。順鉑耐藥是宮頸癌化療的常用藥物，本實驗通過順鉑梯度暴露法構建順鉑耐藥宮頸癌細胞株HeLa/DDP，且發現HeLa/DDP細胞增殖抑制率低于HeLa細胞，而半數抑制濃度高于HeLa細胞，表明HeLa/DDP細胞對順鉑耐藥，構建成功。研究報道circRNA可影響腫瘤細胞的化療耐藥性[11]。circMAN2B2在胃癌組織中高表達；沉默circMAN2B2明顯降低了SNU-16和AGS細胞的活力，存活率，遷移率，但增強了細胞凋亡，circMAN2B2可能通過調節miR-145以及PI3K/AKT和JNK途徑發揮其功能[12]。敲除circMAN2B2可通過海綿化miR-217抑制肝癌細胞系Hep-G2和Huh-7的增殖[13]。本實驗發現HeLa/DDP細胞中circMAN2B2表達水平高于HeLa細胞，提示circMAN2B2或與HeLa細胞的順鉑耐藥有關。本實驗進一步抑制circMAN2B2表達的同時用順鉑作用HeLa/DDP細胞，結果顯示，細胞增殖抑制率升高，細胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高；表明抑制circMAN2B2表達可抑制HeLa/DDP細胞增殖、促進細胞凋亡；抑制circMAN2B2表達增強了HeLa細胞對順鉑的敏感性。

已有研究報道，miR-216a-3p抑制宮頸癌的增殖和侵襲[7]。且研究報道miR-216a-3p在結直腸癌組織和細胞中下調表達，上調其表達可抑制結直腸癌細胞的增殖[14]。miR-216a-3p可抑制肺癌細胞的活力，遷移，侵襲和增殖，同時促進細胞凋亡[15]。本實驗結果顯示，miR-216a-3p在HeLa/DDP細胞中低表達，表明miR-216a-3p或與宮頸癌的順鉑敏感性有關。此外，本實驗還發現circMAN2B2靶向調控miR-216a-3p；而干擾miR-216a-3p表達逆轉了抑制circMAN2B2表達對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用。

綜上所述，抑制circMAN2B2表達可能通過上調miR-216a-3p增強宮頸癌細胞對順鉑的敏感性。