miR-18b-5p靶向HMBOX1調控前列腺癌細胞增殖、凋亡的分子機制

葉旭明 牛洪流 趙建軍

前列腺癌(prostate cancer，PC)是男性中第二大常見的惡性腫瘤，也是全世界與癌癥相關的死亡的第五大主要原因[1]。在過去的十年中，中國前列腺癌的發病率和病死率顯著增長[2]。盡管在早期發現以及臨床管理方面取得了很大進展，但仍有30%的PC患者在PC根治術或輔助治療后復發[3]。因此，迫切需要尋找更有效的生物標志物或治療靶點來預防、診斷和治療PC。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小的內源性非編碼RNA，可通過mRNA降解或翻譯抑制作用在轉錄后充當其靶基因的負調控因子。據報道，許多miRNA通過調節PC各種生物學過程(例如增殖、遷移和凋亡等)成為腫瘤抑制因子或癌基因[4]。由于在PC的腫瘤發生發病機制中起著至關重要的作用，miRNA在PC的預測、診斷和預后生物標志物或治療靶標上顯示出巨大的潛力[5]。miR-18b-5p是近年來發現的miRNA，在腫瘤(如乳腺癌，肺腺癌和卵巢癌等)的發生和發展中發揮至關重要的調控作用[6-8]。近期Verma等[9]通過CS-miRTar數據庫和miRNA芯片微陣列分析顯示，miR-18b-5p在PC組織的表達下調。然而，miR-18b-5p在PC中的作用及可能的機制鮮有報道。因此，本實驗旨在探究miR-18b-5p對PC細胞增殖和凋亡的影響，以期為PC的診斷、治療及預后提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 前列腺癌細胞系DU145(美國菌種保藏中心)；RPMI-1640培養基(美國Gibco公司)；miR-18b-5p mimics、miR-18b-5p inhibitors及相應對照(廣州市銳博生物科技有限公司)；胰蛋白酶、胎牛血清和Lipofectamine 2000脂質體轉染試劑(美國Invitrogen公司)；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；HMBOX1野生型(HMBOX1-Wt)及HMBOX1突變型(HMBOX1-Mut)熒光素酶重組載體質粒(上海生工生物工程有限公司)；MTT試劑(美國Sigma公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)；裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、ECL檢測試劑(碧云天生物技術研究所)；HMBOX1抗體(美國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標記的IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.2 前列腺癌DU145細胞的體外培養和轉染 前列腺癌DU145細胞常規復蘇后接種到體積分數為10%胎牛血清的RPMI-1640的培養基中，孵育箱培養條件為：體積分數5%CO2、100%濕度、37℃。每隔1 d更換1次新的培養液，待細胞呈單層融合時，以胰蛋白酶消化并傳代。轉染前1 d將生長狀態良好的DU145細胞接種到6孔板中，過夜孵育，待細胞生長匯合達80%以上時進行轉染，采用50 μl不含血清的培養液稀釋miR-18b-5p inhibitor或相應對照，另外，采用50 μl不含血清的培養液稀釋Lipofectamine 2000，各自孵育30 min，將兩種稀釋液進行混合，孵育20 min，將混合液加入到相應每孔細胞中，轉染48 h后，分別收集各組細胞用于相關指標檢測。其中轉染miR-18b-5p inhibitor的DU145細胞設為anti-miR-18b-5p組，轉染對照的DU145細胞設為NC組，未行轉染的DU145細胞設為空白對照(Mock)組。

1.3 qRT-PCR實驗 收集各組DU145細胞，加入Trizol試劑分別抽提總RNA，隨后測定RNA的純度，使用逆轉錄試劑盒將RNA合成第一鏈cDNA，調整cDNA濃度，使用SYBR Green PCR Master Mix檢測試劑盒進行PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性5 min，隨后94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共循環40次。以相對對量2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以U6為內參對miR-18b-5p定量，以GAPDH為內參對HMBOX1定量。見表1。

表1 qRT-PCR檢測所需引物

1.4 雙熒光素酶報告基因實驗 采用TargetScan軟件預測miR-18b-5p的靶基因，結果顯示HMBOX1與miR-18b-5p存在靶向結合序列。構建HMBOX1 3’UTR的野生型(HMBOX1-Wt)和突變型(HMBOX1-Mut)熒光素酶重組載體。將DU145細胞接種到6孔板中，過夜培養，待細胞貼壁后將miR-18b-5p mimics和其對照分別與HMBOX1-Wt或HMBOX1-Mut重組載體共轉染，培養48 h后收集細胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒分別測定螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性，分析細胞的相對熒光素酶活性。

1.5 MTT實驗 用胰蛋白酶消化各組DU145細胞，收集并計數，將細胞密度調整為1×104個/ml，以100 μl/孔接種到96孔板中，培養48 h后，加入100 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，除去MTT溶液，在加入150 μl DMSO，振蕩至沉淀完全溶解，在酶標儀490 nm處各組細胞吸光度(OD)值，以OD值的大小反映細胞活力的高低。

1.6 克隆形成實驗 各組DU145細胞以胰酶消化，離心收集并計數，以1×103個/孔接種到6孔板中，添加新的培養液，放置在37℃培養箱培養，每隔1 d更換液1次，培養14 d左右，待觀察到細胞克隆形成時終止培養，除去培養液，以4%甲醛固定，結晶紫染色，洗去染液風干，在顯微鏡計數(>50個細胞的克隆)細胞克隆數，計算各組細胞克隆形成率，克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.7 流式細胞術 收集轉染48 h后各組DU145細胞，以預冷的PBS洗滌2次，計數約1×105個細胞，添加100 μl結合緩沖液懸浮各組DU145細胞，再分別添加AnnexinⅤ-FITC和PI染液5 μl，充分混勻，于室溫下避光染色15 min，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，并采用CELL Quest軟件分析細胞凋亡率。

1.8 Western blot實驗 收集轉染48 h后各組DU145細胞，加入裂解液冰上裂解15 min，提取總蛋白，蛋白以BCA試劑盒進行定量，蛋白樣品于沸水中煮沸10 min致變性，取40 μg蛋白行10% SDS-PAGE電泳，分離蛋白后電轉至PVDF膜上，隨后封阻2 h，TBST漂洗3次，加入相應稀釋的HMBOX1一抗(1∶800稀釋)，4℃過夜孵育，再以TBST漂洗3次，加入稀釋的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫孵育2 h，滴加ECL進行顯影，使用凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作內參，Imag J軟件分析各組DU145細胞中HMBOX1蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 瞬時轉染下調DU145細胞中miR-18b-5p的表達 在DU145細胞中瞬時轉染miR-18b-5p inhibitors 48 h，qRT-PCR分析結果顯示，與Mock組比較，miR-18b-5p在anti-miR-18b-5p組DU145細胞中的表達量顯著下調(P<0.05)，HMBOX1 mRNA在anti-miR-18b-5p組中的表達量顯著上調(P<0.05)，而NC組miR-18b-5p和HMBOX1 mRNA的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組DU145細胞中miR-18b-5p和HMBOX1 mRNA表達量比較

2.2 miR-18b-5p靶向HMBOX1的預測和驗證 TargetScan預測結果顯示，HMBOX1的3’UTR與miR-18b-5p具有互補結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗分析結果顯示，過表達miR-18b-5p能夠明顯抑制HMBOX1-Wt的相對熒光素酶活性(1.00±0.10 vs 0.30±0.03，t=20.114，P<0.05)，而對HMBOX1-Mut的相對熒光素酶活性無顯著影響(0.99±0.09 vs 0.98±0.09，P>0.05)。Western blot結果顯示，與Mock組比較，HMBOX1蛋白在anti-miR-18b-5p組中的表達量明顯上調(0.27±0.03 vs 0.52±0.05，P<0.05)。見圖1。

2.3 抑制miR-18b-5p可抑制DU145細胞的增殖能力 MTT實驗和克隆形成實驗結果顯示，與Mock組比較，anti-miR-18b-5p組DU145細胞活力和克隆形成率均明顯降低(P<0.05)，而NC組細胞活力和克隆形成率差異不顯著(P>0.05)。見表3。

表3 3組DU145細胞活力和克隆形成率比較

2.4 抑制miR-18b-5p可促進DU145細胞凋亡 流式細胞術檢測結果顯示，與Mock組比較，anti-miR-18b-5p組DU145細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，而NC組細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖2。

圖2 流式細胞術檢測DU145細胞凋亡情況

表4 4組DU145細胞凋亡率比較

2.5 下調HMBOX1逆轉抑制miR-18b-5p對DU145細胞增殖和凋亡的影響 為探究miR-18b-5p是否通過負向調控HMBOX1影響DU145細胞增殖和凋亡，本實驗在DU145細胞中共轉染miR-18b-5p inhibitors和HMBOX1 siRNA，48 h后分別通過Western blot、MTT和流式細胞術檢測HMBOX1蛋白表達水平、細胞活力和凋亡率，結果顯示，與anti-miR-18b-5p組比較，miR-18b-5p+si-HMBOX1組DU145細胞中HMBOX1的表達明顯升高(P<0.05)，細胞活力升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。見表5。

表5 3組DU145細胞中HMBOX1表達水平、細胞增殖和凋亡比較

3 討論

在過去的幾十年中，PC一直處于全球男性惡性腫瘤死亡率的前列。雄激素剝奪療法可用于PC的早期階段，但是在治療后，該疾病會發展為去勢抵抗性PC[10]。然而，目前很少有能治愈去勢抵抗性PC的有效療法，因此，人們期望找出更有效治療PC的方法。miRNA已被證明是癌癥發展和進程中的關鍵調節劑。從功能上講，miRNA參與許多生物過程的調控，例如細胞分化、增殖、凋亡和細胞周期控制等。根據細胞環境及其靶標，miRNA可以充當癌基因或抑癌基因[11]。miRNA在PC的發生發展中扮演重要角色。如Liu等[12]研究顯示，miR-146a和miR-152在PC患者中異常表達，且與與臨床分期，是否存在骨轉移以及病理分期等密切相關。miR-3648在前列腺癌組織中過表達，過表達miR-3648通過靶向APC2促進了PC細胞系LNCaP的增殖和細胞周期進程[13]。以上這些研究顯示，miRNA可能是PC的良好生物標志物。miR-18b-5p是一種與多種疾病(包括腫瘤)發展相關的miRNA，日益引起研究者的重視。本研究發現，過表達miR-18b-5p能夠抑制PC細胞DU145的增殖，并促進細胞凋亡，這與以往研究相符，例如Xue等[14]的研究發現，miR-18b-5p能夠抑制肺腺癌細胞的增殖。另一項研究顯示，miR-18b-5p通過靶向VMA21抑制卵巢癌細胞的增殖和轉移[15]。此外本實驗證實miR-18b-5p對PC細胞增殖和凋亡的作用機制可能與靶向調控HMBOX1的表達有關。提示miR-18b-5p在PC中是一個具有潛力的腫瘤抑制因子。

大量研究證實，miRNA可以通過靶標mRNA降解或蛋白質合成抑制來調節基因表達，進而調節多種生理或病理過程，包括細胞增殖、分化、應激和死亡[16,17]。miRNA已在幾種類型的癌癥中得到鑒定，并且可以根據其靶基因而發揮正或負調節劑的作用[18]。本實驗通過生物信息學軟件預測發現，HMBOX1可能是miR-18b-5p的靶基因，并且過表達miR-18b-5p能夠抑制HMBOX1 mRNA和蛋白的表達。HMBOX1是一種轉錄抑制因子，首先是從人胰腺cDNA文庫中鑒定并分離出來，并且在人類組織和器官中廣泛存在[19]。之后隨著對HMBOX1的深入探究，發現其在調控組織分化、器官形成、腫瘤發生等中發揮重要作用。最近有報道指出，HMBOX1能夠促進卵巢癌細胞增殖并抑制細胞凋亡[20]。HMBOX1在胃癌中呈高表達，且其高表達通過促進細胞增殖和遷移導致胃癌患者預后不良[21]。HMBOX1通過促進自噬，抑制癌癥干細胞樣表型和免疫逃逸來抑制肝癌的進展[22]。最近陳立等[23]研究顯示，HMBOX1在PC組織中低表達，且可抑制PC細胞的上皮間質轉化及遷移。然而HMBOX1對PC細胞的增殖和凋亡是否存在影響尚無報道。本實驗結果顯示，抑制miR-18b-5p能夠阻礙DU145細胞的增殖并誘導細胞凋亡，該過程可能與靶向上調HMBOX1的表達有關。繼而本實驗采用共轉染同時抑制miR-18b-5p和HMBOX1的表達，結果發現抑制HMBOX1能夠部分逆轉抑制miR-18b-5p對DU145細胞增殖和凋亡的影響。以上這些實驗結果表明，miR-18b-5p通過靶向調控HMBOX1來調節DU145細胞的增殖和凋亡。

總之，本研究表明，miR-18b-5p直接靶向HMBOX1調節PC細胞DU145的增殖和凋亡。因此，miR-18b-5p可能是潛在的分子靶標，有望成為PC診斷和治療的新靶點。