瘦素預處理對小鼠肝臟缺血再灌注損傷炎性因子及肝功能的影響

陳旭光 溫軍業 張曼 王溪溪

肝臟是合成蛋白質、脂肪、能量代謝的重要器官，具有解毒、免疫功能。作為肝動脈、門靜脈雙供血器官，肝臟對缺血敏感程度較高，容易發生肝缺血再灌注損傷(liver ischemia reperfusion injury，LIRI)。LIRI是指肝組織缺血重獲血流灌注后，細胞結構和功能損傷加重，器官功能進一步惡化[1]，常見于巨大肝癌切除、肝血管瘤切除、肝內膽管結石致肝葉萎縮、肝內膽管結石需行肝葉切除、肝移植及休克后復蘇，它是一個多種炎性因子、多種細胞器相關聯的復雜過程，在半肝切除手術過程中，需將肝血流短暫性阻斷，并于切除操作結束后再次開通，因此極易引發肝缺血再灌注損傷。肝臟缺血再灌注損傷過程中，細胞因子，炎性反應，免疫細胞在此過程中起到關鍵作用。主要機制包括氧自由基生成、炎性反應、線粒體損傷、細胞凋亡、Ca2+超載和白細胞的活化等，往往導致機體預后不良[2,3]。壞死的肝細胞釋放大量的細胞因子或者趨化因子，加重肝細胞損傷，造成肝功能障礙。瘦素(Leptin)是參與機體的攝食、體重調節、能量平衡及內分泌免疫等多種功能的重要信號物質，還與神經垂體激素的分泌、大腦發育、腫瘤的發生與發展、心血管系統功能穩態等的調節有關[4]，又是與創傷修復密切相關的代謝因子。近年來，瘦素對肝缺血再灌注損傷的影響備受關注[5,6]，瘦素處理有望成為一種治療肝缺血再灌注損傷的治療方法。本研究通過建立小鼠肝臟缺血再灌注損傷瘦素預處理模型，探討瘦素預處理對小鼠肝臟缺血再灌注損傷炎性因子及肝功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 C57 BL/6雄性小鼠40只，8～10周，體重約18～20 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[合格證號 SCXK(京)2016-0006，動物飼料及墊料均經放射線照射滅菌]，晝夜循環12 h，環境溫度21℃～25℃，相對濕度在65%左右，每5分鐘換氣1次，飼料由河北省人民醫院臨研中心提供。實驗分為4組：假手術組、肝缺血再灌注損傷模型組(LIRI模型組)、LIRI瘦素預處理組和LIRI術后瘦素處理組，每組10只小鼠。

1.2 主要試劑 人工重組瘦素(Recombinant mouse leptin)購自美國R&D Systems 公司，丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒購自北京博邁斯科技發展有限公司，白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)試劑盒購自上海心語生物科技有限公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒和堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自上海佰曄生物科技中心，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)試劑盒購自本生(天津)健康科技有限公司，戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司。

1.3 動物模型的制備及處理 實驗前對4組小鼠均采取24 h禁食、12 h禁水處理。(1)肝缺血再灌注損傷模型組(LIRI模型組)：于小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(40 mg/kg)使其麻醉，取仰臥位將小鼠固定于操作臺上，75%酒精消毒胸腹部，逐層切開腹腔，游離并暴露第一肝門，解剖肝蒂，無創血管鉗分離肝臟左葉、中葉肝蒂及肝右葉肝蒂的分界線，血管夾鉗夾肝左葉及中葉肝蒂，不鉗夾供應右支肝蒂的血管，夾閉血管30 s后肝左葉和中葉的顏色與肝右葉相比，由鮮紅變為淺粉最后變白證明手術成功，拉攏對合皮膚并覆蓋無菌濕紗布，60 min后撤掉血管夾，30 s左右后見可見肝左、肝中葉迅速變為鮮紅色，表明肝缺血再灌注損傷模型制備成功，縫合腹部切口，再灌注6 h后處死小鼠，無菌分離鉗分離采集肝臟和血清樣本。(2)假手術組：75%乙醇消毒小鼠胸腹部，沿腹正中打開腹腔，分離鉗解剖第一肝門，分離小鼠肝蒂左分叉，不夾閉肝葉供血，不進行任何其他處理，最后關腹。(3)LIRI瘦素預處理組：以下稱瘦素預處理組，于肝缺血再灌注術前30 min，給予小鼠腹腔注射重組瘦素，劑量為 50 μg/kg。(4)LIRI術后瘦素處理組：以下稱瘦素后處理組，小鼠肝缺血再灌注損傷術后30 min，給予小鼠腹腔注射重組瘦素，劑量為50 μg/kg。

1.4 小鼠血清制備和肝臟組織取材 各實驗組小鼠于肝缺血再灌注術后6 h被頸椎脫臼處死，采用摘眼球取血法收集血液樣品，在4℃下于離心機中離心(4 000 r/min，10 min)，分離血清保存至-80℃冰箱中待測。之后用酒精對小鼠胸腹部進行消毒，無菌切開腹部正中，取肝臟組織并制備肝組織勻漿。

1.5 MDA和SOD水平的測定 取新鮮肝臟組織100 mg，用無菌剪刀將其剪碎并置于無菌器皿研磨成肝組織勻漿，離心10 min(4℃、80 000 r/min)，取上清液保存至液氮中，檢測標本前于冷水中進行消融，離心10 min(4℃、80 000 r/min)，取上清液，按照試劑盒說明書用分光光度計測定、計算MDA和SOD水平。

1.6 炎性因子及肝功能的測定 各實驗組小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α、ALT、γ-GT和ALP的檢測依據試劑盒說明進行。

2 結果

2.1 4組小鼠肝組織中SOD、MDA比較 與假手術組相比，各實驗組小鼠肝臟組織勻漿MDA含量較高(P<0.05)，SOD含量較低(P<0.05)。與LIRI模型組相比，LIRI瘦素預處理組的MDA較低(P<0.05)、SOD 含量較高(P<0.05)；LIRI術后瘦素后處理組同樣表現為MDA含量較低(P<0.05)、SOD含量較高(P<0.05)。見表1。

表1 4組小鼠MDA、SOD水平指標

2.2 4組小鼠血清中IL-6、IL-10、TNF-α比較 與假手術組相比，各實驗組小鼠白細胞介素-6(IL-6)、小鼠白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平顯著升高(P<0.05)。與LIRI模型組相比，LIRI瘦素預處理組的IL-10水平顯著升高(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平顯著降低(P<0.05)；LIRI術后瘦素后處理組的IL-10水平顯著下降(P<0.05)，IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組小鼠IL-6、IL-10和TNF-α水平指標

2.3 4組小鼠血清中ALT、γ-GT、ALP比較 與假手術組相比，各實驗組丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、小鼠γ-谷氨酰轉移酶(γ-GT)和堿性磷酸酶(ALP)水平均顯著升高(P<0.05)。與LIRI模型組比較，LIRI瘦素預處理組的ALT、γ-GT和ALP均顯著下降(P<0.05)；LIRI術后瘦素后處理組表現為γ-GT和ALP均顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 4組小鼠肝功能指標結果

3 討論

目前，肝臟缺血再灌注損傷的防治措施主要包括：缺血預處理、藥物干預、減少缺血時間等[7]。其中，缺血預處理保護缺血再灌注損傷的機制包括減輕機體的氧化應激反應、抑制胞內鈣離子超載、激活機體線粒體ATP鉀離子通道、減輕炎性發應、改變凋亡相關蛋白等多種機制，從而減少肝臟組織細胞死亡以實現對器官保護作用。通過預處理方式對缺血再灌注損傷器官的保護作用已得到大量實驗支持，相關報道表明預處理在對肝臟、腎臟、腦、心臟、肺等重要臟器的缺血再灌注損傷過程中均有保護作用[8-15]。其中，瘦素是近年來研究較多預防肝缺血再灌注損傷的藥物。瘦素，由白色脂肪細胞分泌，是一種神經肽類物質，主要發揮著平衡能量、脂類代謝、胰島素分泌、調節免疫功能、血紅細胞生成、骨骼建成、血管發生等重要作用[16,17]，與創傷修復密切相關，主要分為游離型和結合型兩種。瘦素進入血液循環后，游離型的瘦素與特異性的蛋白結合，通過血腦屏障，與瘦素受體結合，進行信號傳導，激活下丘腦中樞，參與機體的攝食、體溫調節、能量平衡及內分泌免疫調節。

肝缺血再損傷的關鍵因子之一TNF-α，出現較早，由活化的單核-巨噬細胞釋放的促炎因子，參與急性炎性反應及免疫應答、介導細胞線粒體毒性反應，使肝竇內皮細胞腫脹，激活中性粒細胞并釋放ROS并造成細胞凋亡，干擾肝竇細胞內DNA正常復制，誘發枯否細胞并產生大量ROS，加重多形核粒細胞浸潤和肝細胞損傷，誘發脂類、多肽產生導致肝細胞凋亡。TNF-α能夠刺激血管內皮細胞表達表面黏附分子，加重肝缺血損傷，從而過度釋放大量促炎因子引起的炎癥過度反應綜合征?？梢酝ㄟ^刺激分泌蛋白，促使多臟器功能衰竭的發生，誘導肝缺血再灌注損傷的產生，導致血管通透性改變，進一步引起大量炎性因子和氧自由基的釋放[18,19]，最終引起機體的免疫調節失衡。

肝臟是IL-6主要來源器官，IL-6是體內的一種具有各多種生物學效應的細胞因子，是重要的炎性介質，其主要介導和調節免疫反應及炎性反應，刺激造血功能并參與組織修復。TNF-α能夠激活NF-KB轉錄，從而激活誘導合成大量的IL-6，也介導IL-10的產生。IL-10是一種具有明顯抗炎作用的細胞因子，是一種可以減輕系統性炎性反應并減少炎性細胞因子產生。本研究中發現，血清IL-6、IL-10和TNF-α的水平是判斷炎性反應和患者病情嚴重程度的重要參考指標。其中，TNF-α與IL-10在肝缺血再灌注損傷過程中起的作用是相反的，TNF-α、IL-10比值可以作為肝缺血再灌注損傷嚴重程度的判斷標準。

肝臟缺血再灌注損傷可產生大量的氧自由基。氧自由基異常表達及鈣超載等可能是肝臟外科手術患者肝缺血再灌注損傷的危險因素。氧自由基和生物膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，形成脂質過氧化物如MDA，MDA具有細胞毒性，可加劇細胞膜損傷，影響細胞正常生理功能。因此，通過測定體內MDA含量，可間接反映體內自由基對機體的損傷程度[20]。機體內自身存在氧自由基的清除系統，如酶類SOD、過氧化氫酶、過氧化物酶及維生素類，其中，SOD作為生物體內的一種抗氧化酶，是氧自由基的自然天敵，是機體內氧自由基的頭號殺手，具有強有效的自由基清除能力[21]，催化氧離子的歧化反應，并抑制MDA 對細胞的損傷，進而修復氧化損傷細胞。通過測定MDA和SOD的活性來判斷肝缺血再損傷程度[22,23]。有研究表明，SOD的上調可以明顯減輕肝組織在缺血再灌注中的損傷。本研究結果表明，小鼠肝臟缺血再灌注后，MDA 升高，SOD 下降，以肝缺血再損傷模型組明顯、瘦素預處理組損傷程度明顯較輕(瘦素預處理組小鼠肝臟勻漿組織的MDA含量降低、SOD含量增高)，說明瘦素預處理減少炎性因子的聚集、減輕炎性反應、參與改善TNF-α介導的肝缺血再灌注損傷過程，提示瘦素預處理可減少氧自由基產生并減輕體內脂質氧化程度，降低肝臟缺血再灌注時的肝組織損傷。

肝缺血再損傷過程中，肝臟內細胞ATP產生障礙，鈣離子釋放，凋亡途徑啟動等使細胞加速凋亡。ALT是肝細胞受損后肝功能異常的常用指標之一，主要位于肝細胞細胞質內。ALP是廣泛分布于人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶，主要見于阻塞性黃疸、原發性肝癌、繼發性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查。γ-GT是一種轉移酶，參與谷胱甘肽的代謝，主要來自肝臟，γ-GT的活動性與肝臟疾病有良好的一致性，可作為反映肝細胞損害的指標，用于鑒別肝臟系統疾病，彌補ALP的不足。本研究發現，肝組織缺血再灌注過程中，肝功能指標明顯下降，瘦素預處理可明顯降低肝臟缺血再灌注時的肝組織損傷。

目前，通過動物實驗研究肝缺血再灌注過程中仍在繼續，多種減輕肝缺血再灌注損傷的途徑越來越多。在臨床過程中，對于肝臟較大手術，提前進行多種方式的預處理，可以更快的恢復肝功能，降低肝衰竭可能，使患者受益。綜上所述，瘦素預處理在缺血再灌注損傷過程中，可降低IL-6、TNF-α、MDA的水平，提高SOD活性、IL-10 水平，降低肝功能指標，從而減輕炎性反應、氧化應激，降低氧自由基的產生，減輕機體的炎性反應，降低小鼠肝臟缺血再灌注的損害，為臨床防治提供了理論依據。