SM22α在上皮性卵巢癌組織中的表達及意義

宋玉霞 趙芳 趙濤 周莎莎 王雪娟 郭樺

卵巢癌(Ovarian cancer)是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，發病率占女性生殖系統腫瘤第三位，病死率居于首位[1]。據中國癌癥統計數據顯示，2015年我國新發病例5.21萬例，因卵巢癌死亡病例2.25萬例[2]。卵巢癌患者早期沒有典型的臨床癥狀及特異性的標記物，約70%的患者明確診斷時已為晚期；近年來以手術為主的綜合治療的技術有很大提高，然而其5年生存率仍徘徊在30%左右[3]。目前對卵巢癌的發生發展，以及卵巢癌細胞如何擴散到遠處器官的分子機制并不明確，探討其機制的研究對卵巢癌的預防、早期診斷、綜合治療及預后都具有非常重要的現實意義。平滑肌22α蛋白(smooth muscle 22 alpha，SM22α)又稱為Transgelin，是一種actin細胞骨架相關蛋白，通過與細胞骨架的肌動蛋白結合調節細胞的收縮功能[4]。SM22α作為信號分子參與細胞的分化、生長及細胞外基質重塑等[5,6]。研究表明，M22α可能在腫瘤的發生發展過程中起作用，其在多種癌組織中，如肺癌[7]、乳腺癌[8]、大腸癌[9]等，表達下調或降低。此外，SM22α還可通過抑制基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移能力[10]。本研究應用qRT-PCR和Western blot方法檢測卵巢癌組織中SM22α的表達情況，探討其在卵巢癌發生和發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年12月至2018年12月石家莊市第一醫院婦科手術治療的上皮性卵巢癌患者卵巢癌組織標本43例?；颊吣挲g28～72歲，平均年齡53.4歲，所有患者均為初治行腫瘤細胞減滅術，術前均未行新輔助化療，標本術后經病理確診。組織學類型：漿液性腺癌31例、黏液性囊腺癌4例、子宮內膜樣癌8例；FIGO 手術病理分期：Ⅰ期7例、Ⅱ期3例、Ⅲ期29例、Ⅳ期4例；組織分級：1～2級23例、3級20例。對照組標本選取同期因宮頸癌或子宮肌瘤行全子宮雙附件切除患者的卵巢組織50例，對照組患者術中證實無卵巢子宮內膜異位囊腫或卵巢腫瘤等，術后病理診斷為正常卵巢。標本均在離體后30 min內收集，迅速放入-80℃冰箱里低溫保存備用。標本和資料收集均由患者本人知情同意，并獲得石家莊市第一醫院倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；PCR 引物(上海生工生物工程有限公司)；RevertAid cDNA 合成試劑盒(TaKaRa生物技術有限公司)；QuantinovaTMSYBR? green pcr Kit(上海凱杰生物技術有限公司)；熒光定量PCR儀(7500 型)為美國ABI公司產品；兔抗人SM22α單克隆抗體(Ab-cam公司)；兔抗人單克隆抗體GAPDH(Santa Cruz生物有限公司)；熒光標記的羊抗兔多克隆抗體(Santa Cruz生物有限公司)；雙色紅外熒光掃描系統(美國LI-COR公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 總RNA提取及qRT-qPCR 應用：TRIzol RNA提取試劑盒按照說明書操作提取組織總RNA，Nanodrop2000檢測總RNA的濃度及純度，要求OD260/OD280值位于1.8～2.0。應用逆轉錄試劑盒按照說明書操作將5 μg總RNA逆轉錄合成cDNA，將轉錄好的cDNA于-20℃冰箱保存，用于后續qPCR擴增。應用QuantiNovaTMSYBR? Green PCR 試劑盒進行qPCR擴增反應，PCR反應體系：Green Master Mix 1.0 μl、上游引物 1.4 μl、下游引物 1.4 μl、Rox 0.1 μl、模板cDNA 1.0 μl、最后加雙蒸水至20 μl。qPCR反應條件設定：95℃預變性3 min；然后進行40個循環(95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s)；最后進行95℃變性15 s、58℃退火60 s、95℃延伸30 s。反應引物序列：目的基因SM22α的上游引物 5’-AGGTGTGGCTGAAGAATGGCG-3’、下游引物 5’-TCTTCGTCTACATAATCCTC-3’；內參GAPDH的上游引物 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。根據系統生成的Ct值，采用2-ΔΔCT法計算獲得SM22α基因mRNA的相對表達量，每個標本均設3個副孔，取平均值。

1.3.2 Western blot檢測SM22α蛋白表達情況:解凍卵巢癌組織及正常卵巢組織標本后，取約200 mg用眼科剪將組織塊剪碎后加入蛋白裂解液，組織充分裂解后，4℃離心機上離心提取總蛋白，用定量BCA法進行蛋白定量。制備10% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE濃縮膠，每加樣孔上樣50 μg樣本蛋白，電泳90 min后將分離的蛋白轉至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST液封閉2 h，TBST洗膜后加稀釋好的一抗(兔抗人SM22α單克隆抗體1∶1 000；兔抗人單克隆抗體GAPDH 1∶800)、4℃條件下過夜。TBST洗膜3次后加二抗(熒光標記的羊抗兔多克隆抗體1∶10 000)室溫避光孵育1 h，TBST再次洗膜4次后抗體結合區帶用Odyssey雙色紅外熒光掃描系統進行成像。

2 結果

2.1 SM22α在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達情況 利用qRT-PCR檢測43例卵巢癌組織及50例正常卵巢組織中SM22α mRNA表達水平，結果顯示：卵巢癌組織中SM22α mRNA相對表達水平為(0.72±0.18)，正常卵巢組織中其相對表達水平為(1.45±0.63)，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。Western blot結果同樣顯示：與正常卵巢組織相比，SM22α在卵巢癌組織中的蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 SM22α蛋白表達情況;N：正常卵巢組織，Ca：卵巢癌組織

2.2 SM22α在卵巢癌組織中mRNA表達與蛋白表達的相關性分析 采用Pearson Correlation Coefficients檢驗，分析結果顯示：卵巢癌組織中SM22α mRNA表達水平與其蛋白表達呈正相關性(r=0.701,P<0.05)，表明卵巢癌組織中SM22α mRNA和其蛋白表達趨勢一致。見圖2。

圖2 卵巢癌組織中SM22α基因的mRNA與蛋白表達的相關性

2.3 SM22α基因mRNA表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系 應用t檢驗將SM22α 基因mRNA表達水平與EOC患者各臨床病理參數之間的關系進行統計分析，結果顯示淋巴轉移陽性患者的癌組織中SM22α基因mRNA的表達水平顯著低于淋巴轉移陰性患者的癌組織(P<0.05)，而其mRNA表達水平與患者年齡、臨床分期、組織學分級、腫瘤病理學類型、手術殘余病灶等不相關(P>0.05)。見表1。

表1 SM22α基因mRNA的表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系

2.4 SM22α蛋白表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系 應用t檢驗將SM22α蛋白表達水平與EOC患者各臨床病理參數之間的關系進行統計分析，結果顯示淋巴轉移陽性患者的癌組織中SM22α蛋白表達水平顯著低于淋巴轉移陰性患者的癌組織(P<0.05)，而其表達水平與患者年齡、臨床分期、組織學分級、腫瘤病理學類型、手術殘余病灶等不相關(P>0.05)。見表2。

表2 SM22α蛋白表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系

3 討論

本研究發現卵巢癌組織中SM22α mRNA及其蛋白表達水平顯著低于正常卵巢組織，且卵巢癌組織中SM22α mRNA及其蛋白表達水平表達與卵巢癌患者的淋巴結轉移有相關性。

SM22α通過與細胞骨架蛋白-肌動蛋白結合，參與細胞骨架的重構，在細胞結構穩定和表型分化維持方面起重要作用。近年來研究發現SM22α在肺癌[7]、乳腺癌[8]、大腸癌[9]、前列腺癌[11]等多種惡性腫瘤中異常表達。Thompson等[12]報道了SM22α的表達缺失可導致惡性腫瘤發生；Zhang等[13]研究表明SM22α表達升高可誘導前列腺癌細胞凋亡；Xie等[14]報道了SM22α在結直腸癌組織中表達下調，且其可通過促進細胞的自噬作用來抑制結腸癌細胞的增殖。這些研究表明了SM22α可能是一種抑癌基因。但是，也有研究報道稱SM22α在胰腺癌[15]、食管癌[16]及胃癌[17]等癌組織中表達上調。因此，需要更加系統、深入的研究來明確SM22α在不同類型腫瘤發生、發展過程中的功能及作用機制。

本研究應用qRT-PCR及Western blot檢測了卵巢癌組織中SM22α mRNA及蛋白的表達情況，結果顯示SM22α在卵巢癌組織中的表達水平顯著低于正常卵巢組織，且臨床病理參數分析顯示卵巢癌組織中SM22α mRNA及其蛋白表達水平表達與卵巢癌患者的淋巴結轉移有相關性，然而SM22α在卵巢癌組織中的表達水平與患者的年齡、分期、分化及殘余病灶等無關，表明SM22α基因的低表達可能增加卵巢癌細胞的侵襲能力。本研究結果與先前的研究結果相似，Lawson等[10]研究表明SM22α表達降低可促進基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，從而增加腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。侵襲和轉移是惡性腫瘤的主要特征，在腫瘤的發生發展過程中起重要作用。因此，我們推測SM22α表達下調可能增加了卵巢癌細胞的侵襲能力，從而參與卵巢癌發生發展。但其具體分子機制尚需進一步深入研究和明確。

綜上所述，本研究結果提示卵巢癌組織中SM22α基因mRNA及蛋白表達低于正常卵巢組織，且其表達水平與卵巢癌患者的淋巴結轉移相關，表明SM22α在卵巢癌發生發展過程中可能發揮重要作用，有可能成為卵巢癌分子診斷和治療的重要靶點。