UPLC法測定川芎定痛膠囊中四種成分

佟彬良 吳夢琦 顏文 趙夢然 楊樹民 張卓 秦榮飛 周春華

川芎定痛膠囊為河北醫科大學第一醫院生產的中藥復方制劑，其由川芎、絞股藍、延胡索、白芷、細辛、全蝎等6味藥材組成，主要含有機酸類、生物堿類、香豆素類、三萜皂苷及大量揮發油等活性成分，主要有平肝熄火、調和氣血，通絡止痛之功效，主要用于偏頭痛、緊張性疼痛、叢集性頭痛不伴外感癥狀者，臨床應用療效確切[1]。君藥川芎具有活血行氣、散瘀止痛、祛風燥濕的功效[2]，川芎中綠原酸、阿魏酸具有抗炎、抗氧化活性以及保護神經等藥理作用[3]。君藥全蝎平肝熄風，入絡搜風止痛[4]。臣藥絞股藍具有降血脂、調血糖、增強免疫、抗炎、護肝、抗氧化、保護心腦血管、抗腫瘤等藥理活性[5]。臣藥延胡索主要有鎮痛、活血、理氣之功效，其中延胡索乙素主要有鎮痛、鎮靜等藥理作用[6]。佐藥白芷芳香行氣止痛[7]，其中歐前胡素具有解熱鎮痛、抗菌抗炎、血管舒張等藥理作用[8]。佐藥細辛有祛風散寒、通竅止痛、溫肺化飲之功效[9]。目前川芎定痛膠囊的質量內控標準只有川芎、絞股藍的定性鑒別和絞股藍皂苷的分光光度法的定量分析實驗，還缺乏對多個有效成分的進行含量測定的方法。川芎定痛膠囊中單味藥材的質量控制僅有少量報道，且僅停留在對部分成分的含量測定上，缺少對產品有效成分的整體評價，無法全面有效控制藥品質量[10-14]。因此，本研究建立并應用UPLC法同時測定川芎定痛膠囊中四種有效成分的含量，為其質量標準的完善提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 試藥:川芎定痛膠囊，河北醫科大學第一醫院自制，批號為170923，180725，190301，191013，批準文號：冀藥制字Z05000005；綠原酸(Chlorogenic acid，批號：Y24J7K16726)，阿魏酸(Ferulic acid，批號：H27J7L16718)，延胡索乙素(Rotundinum，批號：Y21S7Y17091)，歐前胡素(Imperatorin，批號：P02J9F64791)，均購自上海源葉生物科技有限公司，以上對照品純度均>98%。

1.1.2 儀器:ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀，配有四元溶劑管理器、柱溫箱、自動進樣器、紫外檢測器(TUV)及Empower色譜工作站(美國Waters公司)，由美國沃特世公司生產。

1.2 測定條件與溶液制備

1.2.1 色譜條件:色譜柱：HSS C18柱(2.1×150 mm，1.8 μm)；柱溫：35℃；流動相：0.2%乙酸(A)-乙腈(B)；流速：0.3 ml/min；檢測波長：254 nm；進樣量：2 μl；梯度洗脫：5%B預平衡10 min，0～10 min：5%～14%B，10～20 min：14%～25%B，20～25 min：25%～30%B，25～35 min：30%～55%B，35～45 min：55%～95%B，45～46 min：95%B，46～47 min：95%～5%B。

1.2.2 對照品溶液的制備:分別精密稱取綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素和歐前胡素對照品適量，加50%甲醇制得混合對照品溶液，于4℃冰箱保存，稀釋濃度依次為12.01、10.06、674.31、38.13 μg/ml。

1.2.3 樣品溶液的制備:將10粒川芎定痛膠囊內容物混勻，精密稱取0.5 g，置具塞量瓶中，精密加入50%甲醇10 ml，稱重，超聲處理40 min，放冷，再稱重，以相同溶劑補足重量差，搖勻，濾過，即得。

1.3 方法學考察

1.3.1 專屬性:以前述UPLC方法分析溶劑空白溶液，川芎定痛膠囊樣品溶液，含有綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的混合對照品溶液，考察各成分的色譜分離情況。

1.3.2 標準曲線與定量下限:以50%甲醇稀釋含有綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的混合對照品溶液，得系列不同濃度標準溶液，綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素和歐前胡素分別在2.40～12.01、2.01～10.06、134.86～674.31、7.63～38.13 μg/ml，采用已建立的UPLC方法檢測，以分析物濃度(x，μg/ml)與峰面積(y)為橫縱坐標進行線性回歸。以信噪比10∶1確定定量下限。

1.3.3 回收率:按照前述樣品溶液制備方法，取批號為180725的川芎定痛膠囊內容物，制備加入混合對照品的樣品溶液共六份，其中分別精密稱取0.25 g，分別精密加入混合對照品溶液，以前述方法采用已建立的UPLC方法檢測，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的加樣回收率及相對標準偏差(RSD)值。

1.3.4 精密度:按照前述樣品溶液制備方法及所建立的UPLC方法，配制一份批號為180725的川芎定痛膠囊樣品溶液連續進樣6次，連續測定3 d，記錄峰面積，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的日內和日間RSD值。

1.3.5 重復性:按照前述樣品溶液制備方法及所建立的UPLC方法，配制6份批號為180725的川芎定痛膠囊樣品溶液進樣分析，記錄峰面積，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量RSD值。

1.3.6 穩定性:按照前述樣品溶液制備方法及所建立的UPLC方法，分別于0、2、4、6、8、10 h對批號為180725的川芎定痛膠囊樣品溶液進樣測定，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的峰面積RSD值。

2 結果

2.1 色譜條件優化 液相色譜條件通常考察如流動相組成、柱溫、檢測波長、提取溶劑的配比等影響分離的重要因素。為了獲得較高的色譜分離效率及提高化合物峰型的對稱性，本實驗主要從流動相組成、柱溫、檢測波長三方面對色譜分離條件進行優化。

2.1.1 流動相組成：對流動相中有機相和水相的組成進行調整，在流動相中加入一定的酸以改善峰形，設置四個不同比例有機相，0.2%乙酸-(50%乙腈+50%甲醇)、0.2%乙酸-甲醇、0.3%乙酸-乙腈、0.2%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈，純水-乙腈，從川芎定痛膠囊內容物樣品的色譜圖可分析，0.2%乙酸-乙腈時洗脫效果較好，峰型對稱性增強，分離度好；與甲醇相比，乙腈作為有機相，壓力較低、洗脫能力較強，故選擇使乙腈為有機相。因此，選擇0.2%乙酸-乙腈為流動相進行梯度洗脫。見圖1。

圖1 不同流動相考組成條件下測定川芎定痛膠囊內容物樣品的色譜圖(a 0.2%乙酸-(50%乙腈+50%甲醇)，b 0.2%乙酸-甲醇，c 0.3%乙酸-乙腈，d 0.2%乙酸-乙腈，e 0.1%乙酸-乙腈，f 0.1%甲酸-乙腈，g 純水-乙腈)

2.1.2 柱溫：考察溫度分別為30℃、35℃、40℃，根據不同溫度下川芎定痛膠囊內容物樣品的色譜圖可分析得出，當柱溫為35℃時，洗脫效果好，峰對稱性增強，因此選擇柱溫35℃進行下一步測定。見圖2。

圖2 不同柱溫條件下測定川芎定痛膠囊內容物樣品的色譜圖(30℃-下、35℃-中、40℃-上)

2.1.3 檢測波長：川芎定痛膠囊所含成分結構類型復雜，參考不同結構類別成分的吸收波長，考察波長分別為205、254、280、320 nm，根據不同檢測波長條件下川芎定痛膠囊內容物樣品的色譜圖對比分析可得，當檢測波長為254 nm時，樣品峰響應值較好，靈敏度好，因此選擇檢測波長254 nm進行測定。見圖3。

圖3 不同波長下測定川芎定痛膠囊內容物樣品的色譜圖；(a 320 nm,b 280 nm,c 254 nm,d 205 nm)

2.2 方法學考察

2.2.1 專屬性:通過比較川芎定痛膠囊樣品、混合對照品與空白溶液的典型色譜圖，各檢測物成分的色譜峰無雜質干擾，峰形良好，保留時間穩定。見圖4。

圖4 川芎定痛膠囊樣品(上)、混合對照品(中)與空白溶液(下)的典型色譜圖;1 綠原酸; 2 阿魏酸; 3 延胡索乙素; 4 歐前胡素

2.2.2 標準曲線與定量下限:以UPLC檢測混合對照品溶液中不同濃度分析物的峰面積，再與其濃度進行線性回歸，結果表明，綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素和歐前胡素的線性關系良好(R2≥0.999)。四個成分的定量下限范圍在0.0027～0.152 μg/ml。見表1。

表1 測定川芎定痛膠囊中四個成分的線性回歸方程

2.2.3 回收率:測定川芎定痛膠囊加入混合對照品后處理的樣品溶液，如表2中結果表明方法回收率良好，川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的回收率在95.62%～102.67%，RSD在2.33%～3.19%。見表2。

2.2.4 精密度:連續3 d測定同批次川芎定痛膠囊樣品溶液，結果表明儀器精密度良好，川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的日內日間精密度RSD值范圍分別在0.89%～1.43%、1.37%～1.96%。見表2。

表2 測定川芎定痛膠囊中四個成分的精密度與回收率結果

2.2.5 重復性:測定6份同一批號川芎定痛膠囊樣品溶液，結果川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量RSD值范圍在1.16%～1.66%，表明方法重復性良好。

2.2.6 穩定性:測定放置不同時間的川芎定痛膠囊樣品溶液，結果川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的色譜峰面積RSD值范圍在1.18%～1.53%，表明川芎定痛膠囊樣品溶液在10 h內穩定。

2.3 方法應用 取4批川芎定痛膠囊樣品，以上述方法進行樣品制備及樣品測定，記錄色譜圖，以標準曲線法對不同批次川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量進行計算分析。見表3。

表3 川芎定痛膠囊中四種成分含量測定結果 mg/g

3 討論

河北醫科大學第一醫院研制的中藥復方制劑川芎定痛膠囊由川芎、絞股藍、延胡索、白芷、細辛、全蝎等6味藥材組成，成分復雜，臨床療效確切。目前質量內控標準只有川芎、絞股藍的定性鑒別和絞股藍皂苷的分光光度法的定量分析實驗，無其他有效成分的含量測定。川芎定痛膠囊中單味藥的質量控制只有少量報道，且僅僅停留在對小部分成分的含量測定上，因此缺少對本中藥復方制劑有效成分的整體評價。由于川芎定痛膠囊為復方制劑，成分組成多樣，十分復雜，有必要將多種有效成分進行整體系統研究。

根據中藥復方君臣佐使原則選擇典型的指標性成分對復方制劑進行質量控制具有重要意義[15-17]。川芎定痛膠囊之君藥川芎中綠原酸、阿魏酸為代表成分，臣藥延胡索中延胡索乙素為代表成分，佐藥白芷中的歐前胡素為代表成分，因此，參考中藥復方君臣佐使配伍原則，選擇四個典型代表成分進行質量控制方法研究十分必要，能夠進一步更加準確對有效成分進行定性定量。

UPLC法具有快速、靈敏、節省溶劑、峰容量高、分析效率高等特點，近年來越來越多的應用于中藥復雜成分的分析[17-22]。川芎定痛膠囊所含成分復雜多樣，因此，本研究采用了UPLC方法，分別從流動相組成，檢測波長，溫度對色譜分離條件進行優化，由于檢測指標綠原酸與阿魏酸為有機酸類成分，為防止此類成分在色譜中拖尾現象，在流動相中加入了不同比例的酸，以改善峰形，經過實驗測定，可知在色譜條件流動相組成：0.2%乙酸水-乙腈，流動相梯度洗脫，溫度為35℃時，峰形良好，分離度高。另外，對樣品提取溶劑進行考察，分別為20%、50%、70%、100%甲醇-水，根據不同濃度的提取溶劑處理的川芎定痛膠囊內容物樣品的色譜圖可分析得出，其中當提取溶劑為50%甲醇-水時，提取效果最佳，因此本實驗利用50%甲醇-水對川芎定痛膠囊內容物進行提取。

本研究建立了UPLC方法測定川芎定痛膠囊中四種化學成分。對建立的方法進行了專屬性、線性、定量限、檢測限、回收率、精密度、重復性、穩定性等方法學驗證。在47 min內綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素四種化合物分離完全，各分析物在測定濃度范圍內線性關系良好，相關系數>0.999，平均回收率>80%，由此證明，該方法良好，可對川芎定痛膠囊中的四種典型成分進行定量。

綜上，本研究建立的UPLC方法簡單、靈敏、穩定，可用于川芎定痛膠囊四種典型成分綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量測定，可為其質量控制研究提供實驗性依據，進一步為其質量標準的完善提供科學依據，進而提高其臨床用藥的安全性和有效性。