枯草芽孢桿菌全細胞催化高效合成α-熊果苷

周祺，呂雪芹，柴雪瑩，劉延峰，李江華，堵國成，劉龍*

1(江南大學，未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122) 2(糖化學與生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

熊果苷是一類天然的糖苷類化合物，由葡萄糖和對苯二酚(hydroquinone,HQ)通過糖苷鍵連接而成，自然界中主要存在于植物果皮及樹葉中。熊果苷具有抗菌[1-2]、抗氧化[3-4]等作用，因而在醫藥領域具有較好的應用。此外，熊果苷作為亮膚劑被廣泛用于各類化妝品中[5]。由于葡萄糖和HQ之間可形成α-和 β-兩種構型的糖苷鍵，因此熊果苷也被分為α-熊 果苷和β-熊果苷兩種。天然存在的熊果苷均是β-型， α-熊果苷可通過有機合成和微生物轉化[6]的方法獲得。相較于β-熊果苷，α-熊果苷在美白功效及安全性方面都更具優勢[7-8]。約60年前，日本學者通過化學法成功合成了α-熊果苷[9]，但該方法存在產物立體選擇性差、反應條件劇烈、產生大量副產物等的不足[10]，因此，更符合綠色環保發展理念的生物轉化法合成α-熊果苷成了目前研究的熱點。α-熊果苷的生物轉化是在一類葡萄糖基轉移酶的作用下，將葡萄糖基轉移至HQ的酚羥基上，并特異性形成α-糖 苷鍵[11-12]。目前研究發現的7種微生物來源的葡萄糖基轉移酶均以HQ作為受體底物，但不同種類的葡萄糖基轉移酶需要不同的供體底物，如蔗糖、麥芽糖、淀粉等[12-13]。

蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorlase，SPase，EC 2.4.1.7)是第一個被研究用于生物轉化合成α-熊果苷的酶，該酶以蔗糖和HQ作為供體和受體底物，特異性合成α-熊果苷。在催化過程中，蔗糖并不需要使用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、二磷酸尿苷(uridine diphosphate，UDP)這類昂貴的物質作為前體[14]，由此推測該酶可利用蔗糖中糖苷鍵斷裂時釋放的能量來形成α-熊果苷中的糖苷鍵；此外，該酶的催化活力也不依賴于輔因子[15-16]。KITAO等[17]的研究表明SPase能夠將α-葡萄糖基轉移到23種酚類及其相關化合物中，且該酶對于α-熊果苷的合成表現出很高的轉糖基化效率，摩爾轉移率達到了65%。變異鏈球菌(Streptococcusmutans)來源的蔗糖磷酸化酶(SmSP)穩定性較好，對蔗糖具有最高的底物親和力。

本文在課題組前期研究的基礎上，以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) WB600和B.subtilisWB800為出發菌株，對S.mutansUA159來源的蔗糖磷酸化酶(SmSPI336L，在本文中表示為Smut)進行異源表達，通過采用整合表達、優化核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS)序列和優化全細胞催化條件的策略，獲得了具有高效催化潛力的重組B.subtilisBS8-P43-RBSopt-3Smut，α-熊果苷的產量可達到 119.44 g/L， 底物HQ的摩爾轉化率為96.56%。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

研究使用的菌株、質粒見表1。大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109用于重組DNA實驗，B.subtilisWB600、B.subtilisWB800為本實驗的出發菌株。菌株、質粒全部保藏在本實驗室。

表1 本研究所用菌株和質粒

1.1.2 培養基與試劑

種子培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基(g/L)：蛋白胨12，酵母粉24，KH2PO42.31，K2HPO412.54，甘油 4 mL/L。115 ℃，20 min。

培養基中添加相應的抗生素(μg/mL)：氨芐青霉素100、卡那霉素50、壯觀霉素100。

PB緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)：分別配制0.2 mol/L 的NaHPO4和0.2 mol/L的Na2HPO4，從中各取39 mL和61 mL，加入蒸餾水定容至1 L，即獲得20 mmol/L，pH 7.0的PB緩沖液。

HPLC流動相：10 mmol/L稀磷酸與甲醇混合，體積比為8∶2。

Prime STAR(max)DNA聚合酶、DNA marker，TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司；分子操作相關試劑盒，上海生工生物工程有限公司；α-熊果苷的標準品，Sigma-Aldrich；其他常規試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 Smut表達框的構建及整合

使用引物yqhB-rh-1F/R，yqhB-rh-4F/R，從B.subtilisWB600基因組上分別擴增待整合位點的上下游同源臂各1 000 bp；使用引物yqhB-rh-2F/R，以質粒p7S6為模板，擴增lox71-spc-lox66序列；使用引物yqhB-rh-3F/R，以質粒pP43NMK-Smut為模板，擴增帶有P43啟動子的目的基因片段P43-smut。

使用引物yqhB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術將上下游同源臂、lox71-spc-lox66序列和P43-smut序列進行融合，獲得待整合表達框yqhB-P43-smut。所用引物見表2。

將表達框yqhB-P43-smut片段分別轉化B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的感受態細胞，通過壯觀霉素抗性標記來篩選陽性轉化子BS6-P43-Smut和BS8-P43-Smut。

1.2.2 Smut表達框中啟動子的替換及表達框整合

使用引物yqhB-rh-2F和pS10-2R，以質粒pS10-566為模板，擴增帶有P566啟動子序列的lox71-spc-lox66-P566片段；使用引物smut-3F和yqhB-rh-3R，以質粒pP43NMK-Smut為模板，擴增目的基因smut。

使用引物yqhB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術將1.2.1中的上下游同源臂、lox71-spc-lox66-P566片段和smut片段進行融合，獲得待整合表達框yqhB-P566-smut。所用引物見表2。

將表達框yqhB-P566-smut片段分別轉化B.subtilisWB600和B.subtilisWB800的感受態細胞，通過壯觀霉素抗性標記來篩選陽性轉化子BS6-P566-Smut和BS8-P566-Smut。

1.2.3 P43-Smut的多位點整合

使用引物yitR-rh-1F/R和yitR-rh-4F/R, amyE-rh-1F/R和amyE-rh-4F/R, ymzB-rh-1F/R和ymzB-rh-4F/R分別擴增得到待整合位點yitR,amyE,ymzB的上下游同源臂。使用引物yitR-rh-2F/3R, amyE-rh-2F/3R, ymzB-rh-2F/3R，以1.2.1中構建完成的表達框yqhB-P43-smut為模板，分別擴增相應的片段。使用引物yitR-rh-zong-F/R, amyE-rh-zong-F/R, ymzB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術得到待整合表達框yitR-P43-smut,amyE-P43-smut,ymzB-P43-smut。所用引物見表2。

將3個表達框片段依次轉化BS8-P43-Smut的感受態細胞，通過壯觀霉素抗性標記來篩選陽性轉化子BS8-P43-2Smut, BS8-P43-3Smut, BS8-P43-4Smut。由于多重抗性標記會影響篩選效率，因此在每一輪基因整合之前，都使用cre-lox系統將壯觀霉素抗性標記消除。

1.2.4smut基因的RBS序列優化及多位點整合

使用RBS預測網站“RBS calculator”(https://salislab.net/software/predict_rbs_calculator)設計smut基因的最優RBS序列RBSopt。

使用引物yqhB-rh-1F和smut-RBS-opt-R，smut-RBS-opt-F和yqhB-rh-4R，以1.2.1中構建完成的表達框yqhB-P43-smut為模板，分別擴增相應的片段。使用引物yqhB-rh-zong-F/R，通過融合PCR技術將這2個片段進行融合，得到將原始RBS序列替換為RBSopt序列的待整合表達框yqhB-P43-RBSopt-smut。所用引物見表2。將表達框yqhB-P43-RBSopt-smut轉化B.subtilisWB800的感受態細胞，篩選得到重組菌株BS8-P43-RBSopt-Smut。

表2 本研究所用引物

續表2

使用1.2.3中的方法構建整合表達框yitR-P43-RBSopt-smut和ymzB-P43-RBSopt-smut，然后依次轉化BS8-P43-RBSopt-Smut的感受態細胞，篩選得到重組菌株BS8-P43-RBSopt-2Smut和BS8-P43-RBSopt-3Smut。

1.2.5 α-熊果苷的全細胞催化

取重組菌株的單菌落接種于20 mL種子培養基中，37 ℃，220 r/min振蕩培養10 h。然后以1% (體積分數)的轉接比例將種子液轉接至30 mL的發酵培養基中，37 ℃，220 r/min振蕩培養11 h。將發酵液低溫低速離心15 min以收集細胞，用pH 7.0，20 mmol/L 的PB緩沖液將細胞洗滌2次。將細胞加入含有50 g/L HQ、310.9 g/L蔗糖的催化反應體系中，該催化反應是在pH 7.0，20 mmol/L的PB緩沖液中進行的。催化容器為250 mL搖瓶，反應體積為20 mL。催化條件為30 ℃，220 r/min振蕩反應22～34 h。

1.2.6 α-熊果苷的HPLC檢測

使用HPLC的方法檢測α-熊果苷的濃度。將Agilent 1200 HPLC配備的紫外檢測器設置波長281 nm，使用Agilent SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相為10 mmol/L的稀磷酸和甲醇，體積比為 8∶2， 流速為0.6 mL/min。控制柱溫為35 ℃，進樣量為10 μL。 樣品處理方法：將全細胞催化液以最高轉速在4 ℃離心10 min后，取上清液用超純水進行稀釋，再使用0.22 μm濾膜除去稀釋液中的雜質。

2 結果與分析

2.1 蔗糖磷酸化酶Smut的整合表達及啟動子替換

為使Smut在B.subtilis中穩定表達，我們選擇B.subtilisWB600[18]和B.subtilisWB800[19]作為出發菌株，將P43-smut表達框分別整合至上述出發菌株基因組的yqhB位點。同時，為使Smut高效表達，我們使用在B.subtilis中能夠高效啟動淀粉酶基因bla轉錄的P566啟動子[19]替換P43啟動子。分別得到了BS6-P43-Smut、BS6-P566-Smut、BS8-P43-Smut和BS8-P566-Smut這4株重組菌株，如圖1-a、圖1-b所示。然后將這4株重組菌株進行全細胞催化合成α-熊果苷，以驗證Smut在不同啟動子的調控下及在不同的宿主中表達時α-熊果苷的合成情況，如圖1-c所示，在B.subtilisWB800中使用P43啟動子時，α-熊 果苷的產量最高，為29.14 g/L，底物HQ的摩爾轉化率為23.56%；而在B.subtilisWB800中使用強啟動子P566時，α-熊果苷的產量最低，為10.10 g/L，表明在B.subtilisWB800中，使用P43啟動子調控Smut的表達對于全細胞催化合成α-熊果苷的效果更好。而在B.subtilisWB600中使用P43和P566啟動子對于α-熊果苷的產量沒有明顯差別，分別為11.71、12.55 g/L。上述結果表明，以B.subtilisWB800作為表達宿主，使用P43啟動子調控Smut的表達有利于獲得較高產量的α-熊果苷。

在重組菌株BS8-P43-Smut的基礎上，我們進一步增加Smut的拷貝數：將構建的2拷貝P43-smut整合表達框轉化BS8-P43-Smut，獲得菌株BS8-P43-2Smut；將3拷貝P43-smut整合表達框轉化BS8-P43-2Smut，獲得菌株BS8-P43-3Smut；將4拷貝P43-smut整合表達框轉化BS8-P43-3Smut，獲得菌株BS8-P43-4Smut。然后將上述4株重組菌株進行全細胞催化，α-熊果苷的產量如圖1-d所示，α-熊果苷產量與smut的拷貝數的增加呈正相關；當整合4個拷貝smut時，α-熊果苷的產量為54.05 g/L，底物HQ的摩爾轉化率為43.70%，表明增加smut基因的拷貝數能在一定程度上提高α-熊果苷的產量。

a-蔗糖磷酸化酶基因smut的整合表達框；b-蔗糖磷酸化酶基因smut在B.subtilis中同源重組的示意圖；c-4株重組菌株全細胞催化22 h時合成α-熊果苷的能力；d-分別整合1、2、3、4拷貝的蔗糖磷酸化酶基因smut的重組菌株在全細胞催化22 h時合成α-熊果苷的能力

2.2 蔗糖磷酸化酶的RBS序列優化

為進一步提高α-熊果苷的產量，我們對P43-smut表達框中RBS序列進行優化[18-19]。使用RBS預測網站“RBS calculator”設計蔗糖磷酸化酶基因smut的最優RBS序列，獲得了理論最優RBS序列RBSopt：5′-ACGATGTAGCTGCTAGATACCAAAAGGA-GGTTTTTTTT-3′[20-21]。預測結果如圖2-a所示。

將原始的RBS序列替換成RBSopt并構建1拷貝P43-RBSopt-smut整合表達框轉化B.subtilisWB800菌株，獲得重組菌株BS8-P43-RBSopt-Smut；將2拷貝P43-RBSopt-smut整合表達框轉化BS8-P43-RBSopt-Smut，獲得重組菌株BS8-P43-RBSopt-2Smut；將3拷貝P43-RBSopt-smut整合表達框轉化BS8-P43-RBSopt-2Smut，獲得重組菌株BS8-P43-RBSopt-3Smut。然后將這3株重組菌株進行α-熊果苷的全細胞催化，結果如圖2-b所示。當將原始RBS序列替換為RBSopt后，BS8-P43-RBSopt-Smut菌株的α-熊果苷合成能力就已接近于BS8-P43-4Smut菌株，為46.33 g/L，底物HQ的摩爾轉化率為37.46%；BS8-P43-RBSopt-2Smut和BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株合成α-熊果苷的能力不斷提高，其中BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株全細胞催化合成α-熊果苷的產量為99.14 g/L，底物HQ的摩爾轉化率為80.15%。上述結果表明，通過優化RBS序列和增加拷貝數能夠實現目標蛋白酶Smut的高效表達，最終提高α-熊果苷的產量。

a-“RBS caculator”預測的不同RBS序列對應的翻譯速率；b-重組菌株BS8-P43-RBSopt-Smut, BS8-P43-RBSopt-2Smut, BS8-P43-RBSopt-3Smut全細胞催化22 h時合成α-熊果苷的情況

2.3 全細胞催化合成α-熊果苷的條件優化

在前面的研究中，我們使用5 mL的反應體系進行全細胞催化，但是發現多個批次之間的α-熊果苷產量不夠穩定。此外，HPLC檢測時發現催化22 h的反應液在產物峰之后始終伴隨著一個面積較大的雜峰(圖3-a)。通過與HQ標準品的出峰時間(圖3-b)比對，確定該雜峰對應的物質就是HQ，這說明在全細胞催化反應進行到22 h時還有一部分HQ未被轉化為產物。因此，我們嘗試將反應體系擴大至 20 mL 并延長催化時間，發現不同批次之間α-熊果苷的產量保持穩定，表明擴大反應體系有利于α-熊果苷的穩定合成。結果如圖3-d所示，當催化時間延長至34 h時，BS8-P43-RBSopt-Smut、BS8-P43-RBSopt-2Smut和BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株催化生成的α-熊 果苷含量均有明顯提高，其中BS8-P43-RBSopt-3Smut菌株累積合成了119.44 g/L的α-熊果苷，底物HQ的摩爾轉化率為96.56%。催化時間超過34 h 后，α-熊果苷的產量趨于穩定，在46 h時檢測到α-熊果苷質量濃度為121.60 g/L。表明α-熊果苷的催化合成在前34 h就基本完成。同時，我們對催化液中的底物HQ濃度進行檢測，如圖3-e所示，發現隨著催化時間的延長，HQ的濃度不斷降低，這也間接證明了適當地延長催化時間可以提高α-熊果苷的產量。

a-重組菌株全細胞催化22 h時催化液中α-熊果苷和對HQ對應的出峰時間和峰面積；b-HQ標準品高效液相色譜出峰時間；c- α-熊果苷標準品高效液相色譜出峰時間；d-重組菌株在不同催化時間時α-熊果苷的積累量；e-重組菌株在不同催化時間時底物HQ的殘留量

3 結論與討論

前期的研究對變異鏈球菌來源的蔗糖磷酸化酶進行分子改造，獲得了具有高效催化合成α-熊果苷潛力的SmSPI336L。本文在此基礎上，將SmSPI336L在B.subtilisWB800菌株中異源整合表達，獲得的重組菌株BS8-P43-4Smut在全細胞催化22 h時α-熊 果苷的產量54.05 g/L，底物HQ的摩爾轉化率為43.70%。通過RBS序列優化策略，并對催化條件進行優化后，重組菌株BS8-P43-RBSopt-3Smut在全細胞催化34 h時α-熊果苷的產量為119.44 g/L，底物HQ的摩爾轉化率為96.56%。與目前已報道的α-熊果苷合成方法相比，利用該方法具有操作簡便、產物轉化率高且產量穩定的優點，為實現α-熊果苷的工業化生產提供了一個新的策略。但是，本研究中全細胞催化合成α-熊果苷是在搖瓶中完成的，為滿足工業化生產的需要，接下來需要放大催化體系，對發酵條件、全細胞催化的策略進行系統地優化。