應用釀酒酵母孢子壁衍生材料向非巨噬細胞HEK293T運送微米顆粒

宋超群，楊巖，李鳳，劉國玉，高曉冬，中西秀樹

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在營養缺陷或極端情況下，雙倍體的酵母會進入減數分裂過程，最終在二倍體細胞中產生4個單倍體孢子，從而對抗外部環境[1]。單個釀酒酵母孢子的直徑在2 μm左右，可用作大分子生物材料[2-4]。然而現有報道中，尚未成功解析釀酒酵母孢子壁的結構[5-8]。本實驗室主要對釀酒酵母孢子進行研究，并且通過高濃度鹽洗脫釀酒酵母孢子表面，在洗脫液中發現了RNA[9]。

HEK293T細胞來源于人胚胎腎細胞HEK293細胞的優化，是生物分子研究中常用到的細胞之一，由于HEK293T細胞的轉染效率高，已成為廣大研究者研究基因功能的一個首選細胞株[10]。HEK293T細胞不同于巨噬細胞，沒有明顯的吞噬作用[11-13]。實驗室發現HEK293T可以吞噬釀酒酵母孢子，且內化效率較高[9]。本研究使用購自Sigma公司的聚苯乙烯乳膠顆粒(latex beads amine-modified polystyrene, beads)，其直徑為2 μm。HEK293T細胞不能內化beads，但是beads通過靜電結合釀酒酵母孢子表面分子后，可以被HEK293T細胞內化。

因此，本文著力研究釀酒酵母孢子表面分子與beads交聯后，能否出現吞噬作用，以及影響吞噬效率的因素[14-15]。本研究為誘導非巨噬細胞內化大顆粒機制研究、釀酒酵母孢子表面的特性研究奠定了基礎[16-17]，也為未來釀酒酵母孢子的醫用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母菌株是以SK-1背景下的二倍體菌株AN120作為野生型(wild type，WT)菌株；大腸桿菌DH5α。本研究所用菌株均為本實驗室保存。

1.1.2 酶及試劑

Lyso-Tracker Red，碧云天生物技術公司；RNase、Protease、Loading buffer，寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；PBS緩沖液、Agrose M、酵母提取物、胰蛋白胨、腺嘌呤、乙酸鉀、葡萄糖、氯化鈉、山梨醇，生工生物工程有限公司；Liticase溶菌酶、山梨醇、RNAiso Plus、beads，Sigma；DNA marker 1kb plus，北京全式金生物技術有限公司；氯仿、異丙醇、戊二醛，中國醫藥集團有限公司。

1.1.3 培養基及其他溶液配制

LB培養基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10， NaCl 5，瓊脂粉20(固體培養基)。

YPAD液體培養基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨20，腺嘌呤3，葡萄糖20。

YPACe培養基(g/L)：酵母提取物10,胰蛋白胨20，腺嘌呤3，乙酸鉀20。

KACe培養基(g/L)：乙酸鉀20。

1.4 mol/L 山梨醇：255 g山梨醇溶解于1 L 0.5% PBS緩沖液。

1.1.4 儀器與設備

DS-Ri2共聚焦熒光顯微鏡，Nikon公司；TY7622振蕩混合器，易擴中國有限公司；QB-128旋轉培養器，其林貝爾儀器制造有限公司；HYL-A電熱恒溫搖床，上海三發科學儀器有限公司；MX 150高速冷凍離心機，日本日立 HITACHI公司；DYY-6C凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；Universal Hood II凝膠成像儀，Bio-Rad(美國)公司；JY92-IIN超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技有限公司；NanoDrop2000，賽默飛世爾科技有限公司公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酵母培養與產孢

本文用到的酵母為AN120(野生型，二倍體)。酵母營養細胞使用YPAD培養基，酵母產孢使用YPACe培養基和KACe培養基。

先將釀酒酵母接入5 mL的YPAD培養基于試管中，放入30 ℃，220 r/min的搖床上培養24 h；將5 mL培養物轉入100 mL的YPACe培養基于搖瓶中，放入30 ℃，220 r/min的搖床上培養24 h；離心收集菌體，再將菌體轉入100 mL的KACe培養基于搖瓶中，放入30 ℃，220 r/min的搖床上培養24 h；取5 μL在顯微鏡下觀察產孢率，統計釀酒酵母和孢子的數量，再用孢子數量除以總數即為產孢率，實驗中的產孢率要達到90%；最后離心收集孢子。

1.2.2 孢子的純化

將收集的細胞重懸于5 mL 1.4 mol/L山梨醇中，向其中加入20 μL的1 mg/mL溶菌酶充分混勻，37 ℃孵育2 h后棄上清液。向孢子中加入5 mL水，超聲破碎20 min，將子囊膜破碎，在顯微鏡下觀察，90%以上的孢子處于游離狀態。以3 000×g，2 min離心收集菌體。用0.5% TritonX-100洗滌3～6次，每次均以3 000×g，2 min離心收集菌體，隨后用水洗滌3次，每次均以3 000×g，2 min，最后離心收集孢子。

1.2.3 釀酒酵母孢子表面RNA的提取

將純化好的孢子進行稱重，加入適量水，使孢子終質量濃度為0.1 g/mL，取500 μL，9 000×g離心1 min， 去除水；加入500 μL 0.6 mol/L NaCl溶液，放入振蕩器振蕩3 min；15 000 r/min 離心，取上清液500 μL， 加入RNAiso Plus(TaKaRa)500 μL[18]。充分混勻，冰上放置5 min；加入200 μL氯仿(國藥)，迅速混勻，冰上靜置15 min；12 000×g4 ℃ 離心15 min； 取600 μL上清液轉入新的1.5 mL 離心管，加入 600 μL 異丙醇，冰上靜置30 min，隨后12 000×g4 ℃ 離心10 min，棄上清液；加入500 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500×g4 ℃ 離心5 min；去除上清液，冰上靜置10 min， 加入50 μL DEPC水。最后用Nano Drop檢測 RNA的濃度。

1.2.4 釀酒酵母營養細胞與大腸桿菌RNA提取

酵母細胞于5 mL YPAD過夜培養，取1 mL于1.5 mL 離心管中，9 000×g離心1 min，加入適量玻璃珠，加入RNAiso Plus(TaKaRa)1 mL 于振蕩器上振蕩1 min，破碎細胞，放置冰上5 min；加入200 μL氯仿，迅速混勻，冰上靜置15 min；12 000×g4 ℃ 離心15 min；取600 μL上清液轉入新的1.5 mL 離心管，加入 600 μL異丙醇，冰上靜置30 min，12 000×g4 ℃ 離心10 min，倒去上清液；加入500 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500×g4 ℃ 離心5 min；去除上清液，冰上靜置10 min，加入50 μL DEPC水。最后在Nano Drop檢測 RNA的濃度。

大腸桿菌于5 mL LB培養基過夜培養，操作步驟同上。

1.2.5 釀酒酵母孢子表面分子的提取

將純化好的孢子進行稱重，加入適量水，控制孢子終質量濃度為0.1 g/mL，取500 μL，9 000×g離心1 min， 棄上清液；加入500 μL 0.6 mol/L NaCl溶液，放入振蕩器振蕩3 min；15 000 r/min 離心，取上清液500 μL。 考慮到NaCl的濃度對于吞噬效率以及表面分子的影響，對0.6 mol/L NaCl進行10倍稀釋，具體稀釋比例可根據后期需要的RNA的量，計算得出對應的 0.6 mol/L NaCl的量，再進行10倍稀釋。

1.2.6 beads的交聯

不加入戊二醛交聯：將beads置于2 mL離心管中，RNA組(加入定量的RNA)，釀酒酵母表面分子組(按照RNA的量，計算出加入釀酒酵母表面分子的量)，加入DEPC水，定容至2 mL。最后置于旋轉儀上(4 ℃，24 h)，充分交聯[19]。

戊二醛交聯：將beads置于2 mL離心管中，向離心管中加入200 μL 2%戊二醛預處理beads，置于30 ℃ 培養箱1 h；離心(5 000×g， 1 min)，并用去離子水洗滌，再離心，重復3次；RNA組(加入定量的RNA)，釀酒酵母表面分子組(按照RNA的量，計算出加入釀酒酵母表面分子的量)，加入DEPC水，定容至2 mL。最后置于旋轉儀上(4 ℃，24 h)，充分交聯。

1.2.7 RNA的檢測

對于釀酒酵母孢子表面分子，分別用RNase(0.5 U) 進行處理，37 ℃，1 h，再進行1.2.6中的交聯。

1.2.8 HEK293T細胞的培養

在長滿HEK293T細胞的培養皿中，去除培養液，加入10 mL新的培養液充分懸浮，并取適量轉入新的24孔培養板中，計數，數量約為2.5×106個，37 ℃培養。

1.2.9 beads的吞噬與顯微鏡觀察計數

將1.2.6中的終產物，3 000×g2 min 離心，去除上清液，加入10 μL 水，混勻，取10 μL加入1.2.8中的HEK293T細胞培養液中，加入30 μL lysosome tracker，37 ℃ 放置1 h。取出培養板，除去培養液，加入100 μL PBS。在顯微鏡下觀察吞噬現象，并計數，計算吞噬的數量，從而得出吞噬效率。

2 結果與分析

2.1 HEK293T細胞對beads的吞噬

首先，在本研究室前期的研究工作中，發現釀酒酵母孢子能夠被HEK293T細胞吞噬，孢子直徑2 μm左右，所以HEK293T細胞對于微米級的顆粒也有著吞噬的作用。為此，研究中購買來自Sigma公司的聚苯乙烯乳膠珠可用于創建乳膠凝集系統，稱為beads，beads表面帶有氨基基團，呈正電荷，直徑2 μm。用beads來進行吞噬研究。研究中將beads和HEK293T細胞共同培養1 h，然后共聚焦顯微鏡下觀察beads內化現象。如圖1所示， beads本身具有藍色熒光，在顯微鏡DAPI下能明顯觀察到；lysosome tracker顯示的紅色即為被吞噬的beads，所以在TRAIC下能觀察到紅色的圓圈即為被吞噬；BF為拍到的beads和HEK293T細胞；MERGE為前3張圖的重疊圖。結果顯示beads能被HEK293T細胞吞噬。考慮到研究中加入的beads的數量是否會改變吞噬效率，因此研究了不同的beads量對于吞噬效率的影響，如圖2所示，100個HEK293T細胞吞噬的beads的數目即為吞噬百分比，進而來表示吞噬的效率，吞噬百分比越高即為100個HEK293T細胞吞噬的beads數目越多。在加入不同量的beads條件下，100個HEK293T細胞吞噬的beads數目在1～2個左右，且差距不大，在后續的研究中使用8×107個beads做吞噬研究。

A-BF; B-TRAIC; C-DAPI; D-MERGE

圖2 不同beads量的吞噬效率

2.2 RNA對于吞噬的影響

本研究用0.6 mol/L NaCl溶液洗脫釀酒酵母孢子表面，從NaCl洗脫液中提取RNA再進行純化，然后將RNA和beads一起孵育綁定，RNA帶負電荷，氨基修飾的beads帶正電荷，通過正負電荷作用力進行綁定，形成RNA-beads后再進行吞噬實驗。研究猜測不同的RNA量對于吞噬效率有影響，所以用不同濃度的RNA綁定beads。為了探究不同來源的RNA是否對beads的吞噬有影響，分別從大腸桿菌、釀酒酵母營養細胞中提取了RNA，并與釀酒酵母孢子壁RNA以及購買的tRNA作了比較，不同RNA的凝膠電泳如圖3所示。如圖4-A所示,50 000 ng的RNA效果最優，因此后續的研究都選用50 000 ng的RNA進行反應；吞噬效率的結果如圖4-B所示，結果表明所有RNA對于吞噬都有促進作用，但是來自釀酒酵母孢子表面的RNA和tRNA有更明顯的促進作用，同時由圖3看出，釀酒酵母孢子表面RNA和tRNA 都是長度非常短的RNA，猜測短鏈RNA更能影響beads的吞噬效率。

圖3 不同RNA純化后的凝膠電泳圖

A-不同RNA的量；B-不同來源RNA

2.3 RNase對beads和RNA-beads吞噬作用影響

為了進一步確認RNA對于beads的吞噬有著促進作用，因此有必要在體系中分別用RNase處理beads和RNA-beads，再和HEK293T細胞共同孵育，進行吞噬實驗。如圖5所示，結果顯示RNase不會對beads的吞噬產生影響。對于從釀酒孢子表面的RNA進行純化，并對樣品分別加入RNase(0.5 U)，37 ℃， 1 h，再進行綁定然后觀察吞噬結果。研究發現RNase可以明顯的降低吞噬效率。因此研究中純化的RNA確實對吞噬有促進作用。

圖5 RNase對只有beads吞噬效率的影響和對加入RNA的beads吞噬效率的影響

2.4 釀酒酵母孢子表面分子和戊二醛交聯作用促進吞噬作用

本研究選擇用0.6 mol/L NaCl進行洗脫釀酒酵母孢子表面的分子，由于RNA也是從NaCl洗脫液中提取純化獲得，研究猜想是否洗脫液也會影響beads的內化，所以用beads直接綁定孢子表面洗脫液，對洗脫液進行了10倍稀釋以防高濃度的NaCl影響beads對分子的綁定。如圖6所示，NaCl的洗脫液相對于對照組、純化后的RNA都有明顯提升。考慮到釀酒酵母表面分子的洗脫液中可能還有其他物質，所以使用交聯劑戊二醛去研究是否其他分子也影響了beads的吞噬，戊二醛能夠作為交聯劑，對于氨基、羧基等有著交聯作用。結果見圖6，戊二醛的加入，使吞噬作用有了顯著提升，這說明孢子洗脫液中除RNA外還有其他分子也可以影響beads的吞噬。研究中對戊二醛的影響做了猜測，戊二醛可能交聯了釀酒孢子表面除RNA外的其他分子，對于該分子需要進一步研究。

圖6 戊二醛的加入對不同分子對于吞噬效率的影響

2.5 釀酒酵母孢子表面分子洗脫液中NaCl濃度對吞噬作用影響

本研究選擇用0.6 mol/L NaCl進行洗脫釀酒酵母孢子表面的分子，考慮到NaCl濃度影響，先前實驗在洗脫后進行了稀釋。在此實驗中，加入了不稀釋組，并在稀釋組與不稀釋組2組的最后體系中測量RNA和蛋白質的量，如表1所示，沒有明顯差異。在吞噬作用實驗中，如圖7所示，2組也不存在差異，因此NaCl濃度對于beads綁定分子吞噬沒有影響。

表1 不同濃度NaCl洗脫液中蛋白濃度和RNA總量

圖7 不同濃度NaCl對于吞噬效率的影響

2.6 RNase對釀酒酵母孢子表面分子促吞噬作用的影響

研究發現高鹽洗脫液也可以誘導beads內化，是否高鹽洗脫液中誘導內化的關鍵分子是RNA，為此用RNase處理了高鹽洗脫液。研究中加入了RNase(0.5 U)，在37 ℃放置1 h，再進行綁定交聯然后吞噬觀察結果，如圖8所示，研究發現RNase的處理可以使吞噬數量大幅降低。因此釀酒酵母孢子表面洗脫液中RNA是調節內化的關鍵分子。

圖8 RNase對釀酒酵母表面分子和beads吞噬效率的影響

3 討論

首先，本研究發現釀酒酵母孢子表面的分子可以誘導2 μm顆粒被HEK293T細胞內吞，并對HEK293T細胞內化beads數量做了評估。進一步分析顯示釀酒酵母孢子表面的RNA可顯著影響beads的吞噬，并發現其他物種的RNA也具有誘導beads內化的功能，這說明RNA誘導beads內化具有普遍性。同時研究發現高鹽洗脫液誘導beads內化的效率要比純化后的RNA更為顯著，這說明孢子表面的其他分子也具有調節beads內化的能力，對于該分子有待進一步研究和探討。

釀酒酵母孢子表面結構復雜，由內到外依次是甘露糖層，葡聚糖層，殼聚糖層和二酪氨酸層，最新研究發現孢子表面具有脂滴等結構。0.6 mol/L NaCl 洗脫液中包含了除RNA以外的其他分子促進beads的吞噬，到底是什么分子促進了這一過程需要進一步的探索。在研究中，使用洗脫液孵育戊二醛處理過的beads的吞噬效率最高。對釀酒酵母孢子表面分子和非巨噬細胞的吞噬研究，將為未來藥物運輸的材料和傳遞提供新思路。