多組學解析醬香型大曲風味物質的形成

柳習月，朱琪，楊帆，張娟，張巧玲，李江華，王莉*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學,未來食品科學中心，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)4(貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷，564501)

醬香型大曲是以小麥為原料制成的一種用于醬香型白酒釀造的糖化劑和發酵劑，可為白酒釀造提供微生物、風味物質以及營養底物[1-2]。因此大曲的質量直接關系到酒的風格與品質。在制曲的過程中，小麥被來自于原材料和環境的微生物降解，然后在高溫條件下通過生化過程形成并積累了醬香的風味[3-4]。由于發酵倉內溫度、水分的差異，使得大曲在不同部位的外觀有很大差異。因此，3種類型的大曲一般通過感官評估來區分(例如水分，氣味和顏色)，分別命名為白曲、黃曲、黑曲[5]。在實際的白酒生產中所使用的成熟大曲是3種類型的大曲經過貯存后混合磨碎制成。因此，保證不同曲種產量的連續性并研究它們之間的差異具有重要意義。

近年來，通過不依賴培養的方法探索了大曲發酵過程中微生物群落的組成和動態演替[6-8]。但是，很少有人關心發酵過程中同時形成的3種類型的大曲。因此，我們使用頂空固相微萃取氣質聯用技術[9]比較了不同曲種的揮發性物質，并找到相對的主要風味。通過高通量測序研究不同曲種生物標記的同時借助實時定量PCR分析微生物的絕對定量，并基于絕對定量進行生物標志物和主要風味的相關分析。研究為區分不同曲種提供了代謝標記，并探討了引起代謝物組成差異的生物學因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型高溫大曲來自貴州茅臺酒股份有限公司，在大曲拆倉時從曲倉不同部位隨機取9個樣，經液氮處理后放于無菌自封袋中，保存于-40 ℃備用。其中BQ1、BQ2、BQ3為黑曲的3個平行樣，YQ1、YQ2、YQ3為黃曲的3個平行樣，WQ1、WQ2、WQ3為白曲的3個平行樣。

乙酸銨、氨水、福林酚、甲醇、乙腈、2-辛醇，上海國藥集團；土壤DNA試劑盒、Quant-iT PicoGreen dsDNA分析試劑盒，賽默飛；Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads試劑盒，南京諾唯贊。

1.2 儀器與設備

7890B氣相色譜儀，安捷倫；Q-Exactive HF X質譜儀，Thermo Fisher Scientific。

1.3 實驗方法

1.3.1 醬香大曲酶活性測定

將大曲和緩沖液按照料液比1∶10(g∶mL)浸提，得到大曲粗酶溶液，用于下一步的酶活性測定。根據CUPP-ENYARD[10]描述的方法，以酪蛋白作為測定蛋白酶的底物。一個單位蛋白酶活性(U)定義為1 min釋放1 μg酪氨酸的酶量。如ZHANG等[11]所述測定糖化酶和淀粉酶活性。一個單位淀粉酶活性(U)定義為在5 min內釋放1 mg葡萄糖的酶量。一個單位的糖化酶活性(U)定義為在30 min內釋放1 mg葡萄糖的酶量。使用羧甲基纖維素作為底物，根據DASHTBAN等[12]的方法測量纖維素酶活性。一個單位纖維素酶(U)被定義為在合適的條件下在5 min內水解底物以產生1 mg葡萄糖所需的酶量。

1.3.2 頂空固相微萃取氣質聯用技術分析代謝物

5 g大曲樣品與20 μL 2-辛醇(10 mg/L)混合作為內標，用SPME纖維(50∶30 mm二乙烯基苯-羧基-聚二甲基硅氧烷)在60 ℃下萃取30 min。在DB-Wax色譜柱(60.0 m×0.25 mm， 0.25 μm)上進行化合物的分離。氦氣以1 mL/min的恒定流速用作載氣。在50 ℃下保持2 min，以5 ℃/min到145 ℃，然后以15 ℃/min到230 ℃，并保持5 min。質譜儀以電子碰撞模式操作，電子能量設置為70 eV，掃描范圍為33～400m/z。MS源和四極桿的溫度分別設置為200、230 ℃。使用美國國家標準與技術研究所和Wiley數據庫鑒定每種化合物。選擇正負匹配度>800的化合物。根據內標峰面積與風味物質峰面積的比值，計算出大曲揮發風味的相對濃度。

1.3.3 高通量測序

按照制造商的說明，利用土壤DNA試劑盒提取總基因組DNA樣品，樣品在-20 ℃下保存。使用正向引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和反向引物907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對細菌16S rRNA基因V4～V5區進行PCR擴增。使用正向引物ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和反向引物ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對真菌ITS1區域擴增。將樣品特異的7-bp條形碼摻入引物中，以進行多重測序。PCR擴增子利用試劑盒進行純化以及定量。定量后，將等量的擴增子合并，并使用位于上海個人生物技術有限公司的帶有Illlumina MiSeq平臺和MiSeq試劑盒v3的雙末端2×250 bp測序。序列數據分析主要使用QIIME和R軟件包(v3.2.0)進行。

1.3.4 細菌和真菌總數的定量分析

分別為插入200 bp長讀段的16S rDNA引物Eub338(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和Eub518 (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)構建標準曲線。對于ITS rDNA引物，插入了300 bp長的ITS1f(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和5.8 s(5′-CGCTGCG-TTCTTCATCG-3′)。在實時熒光定量PCR系統(Roche)上確定樣品中16S rDNA和ITS rDNA的絕對拷貝數。實時熒光定量PCR程序包括在95 ℃進行30 s的初始變性步驟，然后在95 ℃進行5 s變性的40個循環，在60 ℃進行30 s的退火。所有樣品(包括標準品和無模板對照品)均一式三份進行測試。使用Origin 2018可視化量化結果，并通過R測試組之間的顯著差異。

2 結果與分析

2.1 醬香大曲中主要酶的活性

小麥中富含淀粉和纖維素，可用作生產大曲的原料。大曲中可將淀粉和纖維素分解為葡萄糖的主要酶類有淀粉酶，糖化酶和纖維素酶[13-15]。葡萄糖作為微生物最常用的能量物質，為微生物的生長和繁殖提供了能量。它通過糖酵解途徑參與了微生物的中央碳代謝，并且與各種代謝物如丙酮酸的合成密切相關。從酶活性水平來看(表1)，白曲、黃曲中酶活性較高，可以實現原料的綜合利用。白曲中的糖化酶活性明顯高于其他大曲(P<0.001)，具有很強的糖化能力，可以有效地實現淀粉和葡萄糖的轉化。黑曲中的纖維素酶活性明顯高于其他大曲(P<0.001)。一方面，黑曲中的纖維素酶可以分解小麥纖維素，使淀粉暴露出來。另一方面，黑曲中的纖維素酶可以將纖維素分解為葡萄糖，以滿足微生物的生長。此外，白曲中的蛋白酶活性遠高于其他酶(P<0.001)，這對蛋白質的利用具有積極作用，并為進一步形成氨提供了氨基酸。

表1 不同曲種中酶活性 單位：U/g

2.2 醬香大曲中不同代謝物的分析

2.2.1 不同曲種代謝物組成

9個樣品中總共鑒定出66種揮發性化合物。黑曲、黃曲和白曲中分別有43、47和43種物質，其中3種大曲共有的物質有23種(圖1-a)。根據化合物的濃度繪制熱圖(圖1-b)，所有化合物主要分為7組，包括12種醇，10種酸，5種酯，9種醛，11種酮，15種吡嗪和4種酚。吡嗪，醇和酸在所有組中均占主導地位，其中白曲中的吡嗪濃度顯著高于黑曲和黃曲，而黃曲中的醇和酸含量高于其余曲種(圖2-a)。醇類物質中含量較高的是異戊醇和苯乙醇，酸中含量高的有乙酸，二甲基丙二酸和戊酸，吡嗪類物質中高含量的有2,5-二甲基吡嗪，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪。

2.2.2 不同曲種特征風味物質解析

利用偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)分析3種類型大曲的代謝組成的相似性。PLS-DA得分圖(圖2-b，Q2> 0.9)顯示，9種樣品根據大曲類型分為3類，表明不同曲種之間代謝物具有顯著差異。同時，通過計算可變重要性的投影(variable importance for the projection，VIP)表示變量對組間差異的貢獻值，VIP值> 1表示“重要”變量。由圖2可知共有16種代謝物對代謝差異有重要影響(圖2-c，VIP值>1)，其中乙酸，3-辛醇和戊酸是黃曲的特征物質(P<0.05)。 乙酸可通過酯化反應與醇進一步合成為酯如乙酸乙酯等，對白酒的特殊風味做出了巨大貢獻[16-18]。2,5-二甲基吡嗪，三甲基吡嗪和四甲基吡嗪對白曲的代謝組成有巨大貢獻，且這幾種物質在白曲中含量豐富。其中四甲基吡嗪具有令人愉悅的堅果味、烘烤味和烘烤味，常見于醬香型白酒中，因此可被定義為白曲的特征風味物質[19]。盡管黑曲中沒有顯著的代謝物，但在黑曲中檢測到了7種特定物質(圖1)，包括1種醇，2種酯，2種醛和2種酮，其中2,3-丁二醇含量最高，可視為黑曲的特征風味物質。

a-大曲代謝物韋恩圖; b-大曲代謝物組成熱圖

a-大曲中主要物質的質量分數; b-代謝物的PLS-DA評分圖; c-重要代謝物的VIP圖

2.3 不同曲種的微生物解析

2.3.1 不同曲種菌群結構

所有樣品中共檢測到150個細菌屬和44個真菌屬。不同曲種中檢測到的大多數屬于厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和子囊菌門，平均相對豐度分別為89.47%、5.58%、4.91%和97.26%。選擇前20個優勢細菌屬和前10個優勢真菌屬進行分析。結果表明，不同曲種的細菌群落主要由4個優勢細菌屬(圖3-a)組成：Kroppenstedtia、Bacillus、Thermoactinomyces和Saccharopolyspora，其中所有樣品的總相對豐度平均為85.65%。利用線性判別分析效應值(linear discriminant analysis effect size，LEfSe)以鑒定3種類型大曲的潛在生物標志物(圖3-b、圖3-d)，Bacillus為白曲生物標志物(LDA> 4)，Saccharopolyspora是黃曲的生物標志物(LDA> 4)。黑曲中相對豐度最高的是Lactobacillus(1.35%)以及Escherichia_Shigella(6.67%)，其中Escherichia_Shigella是黑曲的生物標志物(LDA> 4)。

對于真菌屬(圖3-c)，Paecilomyces、Thermoascus和Thermomyces平均總相對豐度為96.88%，在黑曲和黃曲中占主導地位。其中Paecilomyces的相對豐度在不同曲種間存在顯著差異，在黑曲中相對豐度可達67.94%，但在白曲中相對豐度僅0.24%。Thermomyces在黃曲中相對豐度最高(37.04%)，可視為黃曲的真菌生物標記。白曲的真菌群落組成主要由Thermoascus、Aspergillus和hypophoichia(88.33%)組成，這3種微生物在白曲中豐度比在其他兩種類型的大曲中豐度高得多，可確定為白曲的生物標記。

a-細菌群落組成; b-細菌LEfSe分析; c-真菌群落組成; d-真菌LEfSe分析

2.3.2 大曲中細菌和真菌的絕對定量

基于實時熒光定量PCR的定量比較3種類型的大曲之間的細菌(圖4-a)和真菌(圖4-b)微生物的生物量。總細菌生物量和真菌生物量具有相同的趨勢，其中白曲細菌和真菌數量最多，而黑曲最少。此外，各組大曲之間的定量差異顯著(P<0.05)。同時，還值得注意的是，細菌生物量顯著高于真菌生物量，并且其倍數變化為4～14。通過將相應的相對豐度和總生物量相乘，獲得了每個微生物屬的絕對定量。

a-細菌; b-真菌

2.4 微生物群落與風味物質和酶活力的關聯分析

利用冗余分析[20](redundancy analysis，RDA)根據上面計算的絕對定量分析3種不同類型的大曲中特征性風味物質，酶活性和微生物群落之間的關系(圖5-a)。冗余度分析中的蒙特卡羅置換檢驗表明，微生物與選定的影響因素之間存在顯著的相關性(Pseudo-F=28.2，P=0.004)，并且不同類型的大曲之間存在很大差異。

根據前向選擇和長期效應的結果，結果保留了4種代謝物和3種酶(圖5-a)。保留的影響因素解釋了大曲微生物群落組成總變化的90.14%(RDA1和RDA2)。根據簡單效果的結果比較了影響因素的解釋率。糖化酶(解釋率=71.3%，P=0.002)、酸性蛋白酶(解釋率=71.3%，P=0.002)、堿性蛋白酶(解釋率=70.9%，P=0.01)和四甲基吡嗪(解釋率=65.8%，P=0.006)對大曲的微生物群落組成的總體變化有很高的單獨解釋率。從RDA分析圖可以看出，Paecilomyces與Thermomyces兩種微生物之間為正相關，兩微生物在3-辛醇以及乙酸上的投影點位于其正方向，表明物種與環境因子間為正相關。因此，可得出結論Paecilomyces、Thermomyces與3-辛醇和乙酸呈正相關。同上分析可得Escherichia_Shigella與2,3-丁二醇呈正相關；四甲基吡嗪與Bacillus、Staphylococcus呈正相關；糖化酶和蛋白酶與多種優勢微生物呈正相關，包括Bacillus、Exiguobacterium、Scopulibacillus、Aspergillus等；糖化酶、蛋白酶與四甲基吡嗪呈正相關。以上分析結果表明，芽孢桿菌與糖化酶、蛋白酶和四甲基吡嗪具有強的相關性。

芽孢桿菌是大曲中四甲基吡嗪微生物合成的主要來源[21-23]，并具有高產糖化酶的功能[24]。功能菌株如芽孢桿菌中的四甲基吡嗪的合成過程可分為三個部分(圖5-b)[19]。首先，丙酮酸通過糖酵解途徑產生，兩個丙酮酸分子通過縮合形成α-乙酰乳酸。其次，將α-乙酰乳酸脫羧以產生乙酰丁酸酯。最后，乙酰丙酮和氨進行非酶反應生成四甲基吡嗪[25]。分析可得，白曲中糖化酶和蛋白酶與芽孢桿菌以及四甲基吡嗪密切相關，在這幾種酶的作用下可以有效地分解原料，并為微生物的生長提供碳源，氮源和氨基酸等營養。此外，糖化酶可以通過分解淀粉產生葡萄糖的方式促進丙酮酸的產生，并為形成乙酰丙酮(四甲基吡嗪的前體)提供物質基礎。蛋白酶可以將蛋白質分解為氨基酸，這為氨的形成提供了物質基礎[26]。因此，這3種酶可用作代謝途徑的一部分，為微生物合成四甲基吡嗪提供了驅動力。總之，糖化酶和蛋白酶可用作微生物合成四甲基吡嗪的驅動因子。

a-大曲微生物與代謝物冗余分析; b-大曲中四甲基吡嗪代謝通路

3 結論與討論

利用多組學技術對不同曲種進行解析，明確了不同曲種中微生物、代謝物的組成及差異，揭示了微生物以及代謝物之間的關聯性，為大曲生產工藝的優化奠定科學基礎從而達到優化白酒品質的目的。研究表明黃曲的特征風味物質為乙酸、3-辛醇以及戊酸，白曲的特征風味物質為四甲基吡嗪，黑曲的特征風味物質為2,3-丁二醇；糖多孢菌和嗜熱真菌是黃曲的標記微生物，芽孢桿菌、熱子囊菌和曲霉是白曲的標記微生物，黑曲的標記微生物為擬青霉菌。白曲中高含量的芽孢桿菌對醬香白酒中四甲基吡嗪的提供具有重要貢獻。同時，糖化酶和蛋白酶是芽孢桿菌生物合成四甲基吡嗪的重要作用因素。上述研究對于優化大曲風味以及為后續的白酒釀造提供高質量大曲提供了理論基礎。后期工作可以利用定量蛋白質組學解析大曲中影響風味物質形成的酶類，實現大曲功能以及大曲中各物質之間關系的全面解析。