乳酸菌發酵乳清蛋白藍莓汁體系貯藏期抑菌效果研究

陸桂兵， 王文瓊， 于倩， 李健駒， 顧瑞霞

(揚州大學 食品科學與工程學院，江蘇乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇 揚州，225127)

藍莓又稱越橘，杜鵑花科越橘屬多年生落葉或常綠灌木，被世界衛生組織認為是抗氧化性最強的水果之一，常被譽為“漿果之王”[1]。藍莓果實中含有豐富的花青素, 花青素被認為是藍莓抗氧化、視力保護、抗癌、抗輻射、抗衰老、增強免疫力等作用的主要物質基礎[2]。花青素能夠破壞細菌表面細胞膜，從而使細菌內容物滲漏，最終導致細菌的死亡，因此，對于致病菌有良好的抑制作用[3]。ZHOU等[4]用藍莓花青素處理細菌，細菌的核酸漏出量和蛋白質釋放量顯著增加，且細菌數量明顯降低[5]。同時，藍莓中的酚類物質對多種致病菌均有抑制作用，尤其對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等常見致病菌有很強的抑制作用。酚類物質可以通過改變細胞膜流動性來使細胞通透性增加，從而使細胞內容物流出，導致細胞新陳代謝紊亂[6]。在酸性環境下，非極性酚類化合物質的酚羥基電離度減小，疏水性增強，通過溶解在細胞膜的脂類和和蛋白質的疏水區域來破壞細胞膜完整性[7]。

已有研究發現，德式乳桿菌保加利亞亞種可通過水解α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，有效降低乳清蛋白的過敏性。此外，保加利亞乳桿菌發酵還可提高α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的消化率，降低乳清蛋白的抗原性。德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌聯合發酵對降低甜乳清和脫脂乳中的β-乳球蛋白抗原性也非常有效[8]。但對乳清蛋白發酵以及乳清蛋白和藍莓汁共發酵產物的抑菌特性研究較少[9]，目前本課題組發現乳清蛋白藍莓混合汁發酵可以提高體系顏色穩定性和抗氧化能力的保持[10-11]。由于乳酸菌被稱為公認安全(generally recognized as safe，GRAS)菌株，所以乳酸菌產物稱為GRAS物質已經廣泛應用于多個國家的食品保鮮領域[12]。保加利亞乳桿菌[13]、德氏乳桿菌保加利亞亞種[14]、嗜熱鏈球菌[15]植物乳桿菌[16]，可產生細菌素等殺菌物質，可對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特菌等產生抑制作用[17-18]。副干酪乳桿菌在發酵過程中，可有效抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。

目前的藍莓風味酸奶，主要是在酸奶發酵結束后，將藍莓果漿與酸奶混合后包裝，藍莓的主要成分基本在貯藏期間被微生物利用。在較低的pH環境下，藍莓很難被微生物充分發酵。本文利用乳酸菌發酵乳清蛋白藍莓汁混合物，通過測定抑菌圈的大小、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)含量、電導率初步探索乳酸菌發酵藍莓乳清蛋白體系對3種致病菌(金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌)的抑制效果，為乳清蛋白藍莓汁混合乳酸菌發酵產物作為新型天然抗菌劑提供理論依據，未來可以在功能食品，食品包裝，醫藥等領域應用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

保加利亞乳桿菌134、嗜熱鏈球菌99、副干酪乳桿菌W125和植物乳桿菌67、指示菌(金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和沙門氏菌)，江蘇乳品生物技術與安全控制重點實驗室；乳清蛋白粉(蛋白含量80%)，上海昊岳食品科技有限公司提供；2019年成熟的大興安嶺野生藍莓(51° 55′ N, 124°34′ E)；AKP試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 樣品預處理

(1)原料的選擇：選擇包裝完好，冷藏良好的新鮮罐裝藍莓，提前解凍。取藍莓果肉與果汁混合物100 g倒入榨汁機中然后加水，打開開關。過濾：將榨汁機中的藍莓汁倒出，用紗布進行過濾，重復過濾3次。(2)調配：過濾液加去離子水定容至600 mL，使得藍莓與水的質量比為1∶5。加入乳清粉：向調配液中加入6%的乳清蛋白以及6%白砂糖。調pH至6.5和7.0。(3)滅菌：將配制成的藍莓乳清蛋白飲料置于95 ℃水浴鍋水浴滅菌5 min。(4)接菌發酵：分別接入保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌混合菌種以及植物乳桿菌、副干酪乳桿菌混合菌種，混合菌種中的2種菌以1∶1混合，接種量為2%(活菌數為7 lgCFU/mL)，樣品置于37 ℃恒溫箱培養[10]。(5)樣品：共計6組樣品，如表1所示。

表1 實驗樣品分組

1.3 實驗方法

1.3.1 抑菌圈測定

將30 mL滅菌的LB瓊脂培養基(瓊脂質量分數2%)傾注于直徑為90 mm的無菌培養皿中，保持水平待其凝固作為底層，取稀釋好的致病菌菌液100 μL均勻涂布于吹干的平板上，用直徑10 mm的無菌打孔器在菌層打孔后，用無菌鑷子將孔中央培養基夾出，使其形成直徑10 mm的圓孔，向孔洞內加入待測樣品200 μL。將平板放置20 ℃培養箱，擴散過夜，之后37 ℃培養10 h后觀察有無抑菌圈形成，并測量其抑菌直徑。

1.3.2 堿性磷酸酶測定

取1.3.1中所制菌液的上清液，依照堿性磷酸酶試劑盒說明書測定金黃色葡萄球菌培養液的AKP活性，分別測量3次取平均值。

1.3.3 電導率測定

取1.3.1中所制菌液的上清液，用酶標儀在450 nm測金黃色葡萄球菌培養液、枯草桿菌培養液以及沙門氏菌培養液電導率(OD450nm值)。

1.4 實驗數據處理

每個試驗重復3次，結果表示為平均值±偏差。數據統計分析采用SPSS 11.5軟件(P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著)，采用Origin 8.5 畫圖。相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵液對金黃色葡萄球菌抑菌圈大小測定結果

由圖1可知，藍莓和乳清蛋白混合發酵體系對金黃色葡萄球菌的抑制能力顯著高于乳清蛋白，藍莓單獨發酵體系(P<0.05)。

圖1中0 d表示為發酵結束時。藍莓加乳清蛋白和混合菌種一起發酵的產物對金黃色葡萄球菌抑制性能較高。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合藍莓和乳清蛋白發酵在貯藏第12天時對金黃色葡萄球菌的抑制能力顯著增加(P<0.05)，抑菌直徑為188 mm,比0 d時高出67%。副干酪乳桿菌和植物乳桿菌混合藍莓發酵對金黃色葡萄球菌的抑制能力在貯藏第4天和第12天抑菌能力顯著低于(P<0.05)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合發酵。乳清蛋白混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵抑菌能力顯著高于副干酪乳桿菌和植物乳桿菌混合發酵(P<0.05)。因此混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的發酵液比對應的混合副干酪乳桿菌和植物乳桿菌的發酵液抑菌性能要好，不同微生物菌種利用底物代謝產物不同導致抑菌性能的差別。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產酸主要是乳酸，而甲酸和乙酸的產量相對干酪乳桿菌較少，而甲酸和乙酸的抑菌能力強于乳酸。這說明乳酸菌所產生的酸的抑菌能力影響是部分原因，還與底物的種類和發酵產物有關，包括多酚類，肽類以及多酚和肽類形成的復合物，從圖1可知，在貯藏第12天時，乳清蛋白和藍莓混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌抑菌能力強于對應的混合副干酪乳桿菌和植物乳桿菌的發酵液(P<0.05)。

圖1 乳清蛋白藍莓發酵體系對金黃色葡萄球菌菌體抑菌效果

2.2 金黃色葡萄球菌培養液AKP測定結果

由圖2可知，藍莓和混合菌種以及金黃色葡萄球菌的培養液中AKP含量較高，混合菌種為副干酪乳桿菌和植物乳桿菌時，AKP質量濃度在2 d時最高為0.203 mg/mL，而乳清蛋白和混合菌種以及金黃色葡萄球菌培養液中AKP含量較低，混合菌種為保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌時，在2 d時最低為0.007 mg/mL，原因是藍莓中大量的花青素等多酚物質對金黃色葡萄球菌的影響較大，并且起主導作用。

圖2 乳清蛋白藍莓發酵體系對金黃色葡萄球菌菌體培養液AKP濃度的影響

研究顯示，以植物乳桿菌L.plantarumJ26為發酵藍莓汁。發酵后酚類含量提高了43.42%。高效液相色譜法檢測藍莓汁中主要含有花青素、花青素氯化物、天葵青素和芍藥青素4種花青素，植物乳桿菌J26發酵的藍莓汁對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用均增強。表明藍莓和混合菌種發酵產物能對金黃色葡萄球菌產生較大影響，使得金黃色葡萄球菌的細胞壁和細胞膜產生嚴重的破壞，從而導致AKP的流出。由圖2可知，不同菌種在同一條件下的培養液中AKP濃度相差不大，表明這2種混合菌種在對金黃色葡萄球菌細胞膜和細胞壁的影響能力相當。此外，花青素可以進入膜內，降低單核增生乳桿菌、金黃色葡萄球菌、腸炎鏈球菌和副溶血性弧菌的AKP、ATP酶和SOD活性，從而抑制病原菌的生長。AKP失活可以通過控制去磷酸化進程來阻止細胞分化，有研究報道AKP的含量或活性可以調節Ca2+代謝。花青素處理后AKP活性降低，可能導致Ca2+濃度升高，Ca2+與鈣結合蛋白、相關離子通道和基于磷酸鹽的能量代謝有關。ATP酶是另一種基本代謝酶。較低的ATP酶水平可能導致ATP從病原體流出，阻礙呼吸代謝。一些研究也表明，藍莓中可用的花青素可能通過增加ATP從病原體細胞質流出來發揮作用。通過測定ATP的變化發現肉桂精油抑制了大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的呼吸。

2.3 金黃色葡萄球菌培養液電導率測定結果

細菌細胞膜承擔著菌體Na+、K+等小分子物質交換與信息傳遞等生理功能，菌體的電導率反應細胞膜的通透性的變化。

由圖3可知，藍莓混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌與金黃色葡萄球菌的混合培養液電導率較高，OD450nm在12 d時最高為0.402，乳清蛋白和混合菌種以及金黃色葡萄球菌培養液電導率最低。主要是因為藍莓中的花青素等酚類物質有較強的抑菌性能，從而導致金黃色葡萄球菌細胞膜的破壞以及電導率的升高。但是，由于乳清蛋白與混合菌種的培養液電導率的值通常在0.1～0.2，表示2種乳酸菌的發酵產物都能對金黃色葡萄球菌產生一定影響，即對金黃色葡萄球菌的細胞膜有一定的破壞性。

2.4 發酵液對枯草芽孢桿菌抑菌圈大小測定結果

枯草芽孢桿菌厚壁、折光性強、有抗逆性的休眠體，具有耐高溫能力和抗輻射能力，是在食品工業中經常遇到的污染菌，它們可以引起果蔬、糧食、乳制品、肉類、魚類、禽類、蛋類以及罐頭食品變質，導致一些食源性疾病和食物中毒。由圖4可知，6種混合發酵產物對枯草芽孢桿菌都有一定抑制能力，從2種混合菌種的發酵產物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈來看，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合藍莓和乳清蛋白的發酵產物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈整體上要高于副干酪乳桿菌和植物乳桿菌混合藍莓和乳清蛋白的發酵產物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈。藍莓和乳清蛋白和混合菌種發酵產物對枯草芽孢桿菌的抑菌圈較大，最高能達到200 mm左右，最低76 mm。藍莓和混合菌種發酵產物以及乳清蛋白和混合菌種發酵產物對枯草芽孢桿菌也有一定抑制能力，混合副干酪乳桿菌和植物乳桿菌的樣品抑菌圈在50～100 mm，而混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的樣品抑菌圈在100 mm 左右。在貯藏第4天時，乳清蛋白和藍莓汁合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵體系對枯草芽孢桿菌的抑制能力高于副干酪乳桿菌和植物乳桿菌的發酵體系(P<0.05)。由圖3可知，發酵產物隨著時間的變化對枯草芽孢桿菌的抑制能力大致呈現先升后降的趨勢，在第4天時達到最高。

圖3 乳清蛋白藍莓發酵產物對金黃色葡萄球菌菌體培養液電導率的影響

圖4 乳清蛋白藍莓發酵體系對枯草芽孢桿菌抑菌效果

2.5 枯草芽孢桿菌培養液電導率測定結果

由圖5可知，藍莓混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌與枯草芽孢桿菌培養液電導率最高，且在第4天時，電導率值達到最高，最高值為0.410。

乳清蛋白與混合菌種和枯草芽孢桿菌的混合培養液的電導率最低，0 d時最低值為0.121。說明乳清蛋白乳酸菌發酵后的對枯草芽孢桿菌的抑制作用低于藍莓發酵產物，但隨著貯藏時間的延長，抑菌作用逐漸升高。藍莓中含有豐富的花青素等酚類物質，對枯草芽孢桿菌細胞膜有較強的破壞作用，從而導致電導率的升高。藍莓經植物乳桿菌和副干酪乳桿菌發酵后對枯草芽孢桿菌電導率的影響與保加利亞乳桿和嗜熱鏈球菌混合發酵體系相比差異不顯著(P>0.05)。由圖5可知，乳清蛋白和2種混合菌種的發酵產物也可以增加枯草芽孢桿菌培養液的電導率，但低于藍莓單獨混合乳酸菌發酵產物。主要是部分多酚類物質與蛋白或者肽類結合，通過氫鍵或者共價鍵結合，降低了對枯草芽孢桿菌的破壞作用。

圖5 乳清蛋白藍莓發酵體系對枯草芽孢桿菌培養液電導率影響

2.6 發酵液對沙門氏菌抑菌圈大小測定結果

研究表明，藍莓提取物具有較強的抗菌作用，使膜形態扭曲，細胞內容物滲漏。細胞質成分聚集，在細胞內形成廣泛的中空區域。抑制基因轉錄，破壞細胞膜結構和能量轉運。

藍莓中提取的4種酚類化合物(綠原酸、鞣花酸、槲皮素和槲皮素-3-半乳糖苷)對沙門氏菌具有一定的抑制作用。綠原酸通過阻止丙酮酸代謝而抑制了細菌的能量代謝。同時野生藍莓的原花青素被認為具有抗黏附特性，特別強調防止微生物黏附到腸道上皮組織。一般來說，酚類化合物在低pH條件下可以通過非特異性力量與微生物外膜上的蛋白質復合，如氫鍵和疏水效應，共價鍵的形成，并改變Na+/H+反轉運體系統，降低細菌在低滲透環境下的耐受性。由圖6可知，6種混合發酵產物對沙門氏菌都有一定抑制能力，藍莓加乳清蛋白和混合菌種的發酵產物對沙門氏菌的抑菌圈較大，且副干酪乳桿菌和植物乳桿菌混合藍莓加乳清蛋白的發酵產物對沙門氏菌的抑菌性能更加突出，抑菌圈在貯藏12 d時最高能達到222 mm。乳清蛋白混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌混合的發酵產物對沙門氏菌的抑菌性能也較好，而且在貯藏期間，抑菌能力逐漸升高，說明乳清蛋白藍莓混發酵的產物在貯藏期間不斷變化，而這種變化有助于抑菌能力的提高。在貯藏第12天時，乳清蛋白藍莓混合副干酪乳桿菌和植物乳桿菌以及乳清蛋白混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵抑菌能力無顯著差異(P>0.05)。乳清蛋白混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵體系的抑菌能力顯著高于副干酪乳桿菌和植物乳桿菌發酵體系(P<0.05)。在4 d的時候最高能達到185 mm。而藍莓在發酵結束貯藏第12天，混合副干酪乳桿菌和植物乳桿菌發酵體系抑菌能力顯著高于保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵體系(P<0.05)。乳清蛋白混合保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵體系對沙門氏菌的抑菌性能在貯藏期間有下降趨勢，主要是乳清蛋白進一步被微生物分解，分解產物的抑菌能力降低。

圖6 乳清蛋白藍莓發酵產體系對沙門氏菌抑菌效果

2.7 沙門氏菌培養液電導率測定結果

由圖7可知，沙門氏菌與藍莓和混合菌種混合培養液電導率較高，混合菌種為副干酪乳桿菌和植物乳桿菌時，在12 d時達到最高為0.40。表明在藍莓經過乳酸菌發酵后，使細菌細胞膜遭到破壞，通透性增大，細胞內Na+、K+等電解質外滲到培養液，使菌液電導率增加。

圖7 乳清蛋白藍莓發酵體系對沙門氏菌菌體培養液電導率影響

說明，藍莓混合發酵體系對沙門氏菌的抑制主要表現為破壞菌體結構，主要是藍莓中的多酚類，花色苷，黃酮類物質在經過乳酸菌發酵后，活性成分進一步提高，因此抑菌能力提高[11]。同時乳清蛋白與混合菌種(保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌)和沙門氏菌混合培養液的電導率最低，最低值為0.146。原因是藍莓的花青素等酚類物質具有較強抑菌性，能夠對沙門氏菌細胞膜產生較強破壞，從而使電導率提升。另外，藍莓，藍莓和乳清蛋白混合發酵都有助于多酚及花色苷含量的穩定和提升。在4 d時，各培養液的電導率基本達到最高值。藍莓乳清蛋白混合乳酸菌發酵體系電導率低于藍莓乳酸菌發酵體系，而抑菌圈大于藍莓發酵體系，說明乳清蛋白藍莓混合發酵體系主要表現為抑菌，而藍莓發酵體系主要表現為殺菌作用。

3 結論

本文利用藍莓和乳清蛋白和副干酪乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌以及嗜熱鏈球菌混合發酵，測定發酵體系的抑菌特性。研究顯示，以上6種發酵產物對3種致病菌都有不同程度的抑制作用。結果顯示，盡管藍莓乳清蛋白混合發酵體系的抑菌圈大于藍莓、乳清蛋白單獨發酵體系，但從電導率結果看，藍莓發酵體系對致病菌的抑制效果更好，表明藍莓中的花青素等酚類物質經過乳酸菌發酵對致病菌有著較好的抑制能力。由于6種發酵體系發酵結束時，pH無顯著差別，因此產酸抑菌對本研究不同樣品所產生的不同的抑菌能力影響不顯著。乳清蛋白藍莓混合乳酸菌發酵體系主要表現的是抑菌作用,其殺菌效果低于藍莓單獨發酵體系。未來研究將集中對藍莓以及藍莓乳清蛋白混合發酵抑菌產物進行分離和結構鑒定來制作天然抗菌劑。