真空預(yù)冷結(jié)合氮氣包裝對小白杏采后活性氧代謝的調(diào)節(jié)作用

田全明，魏佳，王曼，鄧豪，王霞偉，伊麗達(dá)娜·迪力夏提，楊海燕，吳斌*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052) 2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊，830091)

新疆杏品種資源豐富，2019年杏種植面積為108 800 hm2， 產(chǎn)量達(dá)到84.38萬t[1]。小白杏是南疆輪臺和庫車地區(qū)特有的品種，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味獨特、營養(yǎng)豐富，深受廣大消費者喜愛。由于小白杏采后機(jī)械損傷和呼吸作用較快，會迅速出現(xiàn)衰老、腐爛、脫水、組織軟化等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響小白杏物流運輸過程中的商品價值[2]。為提高小白杏的物流品質(zhì)，亟需尋找一種有效的保鮮包裝方式以防控小白杏果實在貯運過程中的衰老。

通常在流通前采用預(yù)冷的方法，延長其貨架期[3]。真空預(yù)冷能提高荷蘭豆葉綠素含量，較好地保持貯藏品質(zhì)[4]。在生菜中發(fā)現(xiàn)真空預(yù)冷能保持葉綠體和細(xì)胞的完整性，提高酚類物質(zhì)含量，增強(qiáng)抗氧化能力，延長貯藏期[5]。王娟等[6]在黃花菜中的研究表明，真空預(yù)冷可以快速降溫，去除采后果蔬的田間熱和呼吸熱，抑制呼吸強(qiáng)度的升高，同時減少維生素C和可溶性固形物等營養(yǎng)成分的消耗。真空預(yù)冷在葉菜類應(yīng)用廣泛，但關(guān)于真空預(yù)冷在果品上的研究報道較少，因此，采用真空預(yù)冷方式快速降低果品田間積熱值得深入研究。

N2熏蒸是一種在果蔬采后貯藏領(lǐng)域的氣體熏蒸保鮮方式。低氧環(huán)境可以降低果蔬內(nèi)部超氧陰離子自由基等多種活性自由基的含量[7]，降低膜脂過氧化程度，使果蔬細(xì)胞膜系統(tǒng)維持較好的選擇透過性[8]。90%(體積分?jǐn)?shù))以上的N2處理能推遲呼吸釋放高峰的出現(xiàn)，延緩果實可溶性固形物和抗壞血酸含量下降[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，杏果實經(jīng)N2處理后可顯著延緩果實硬度、可滴定酸含量、總酚含量下降速率，能較好地保持果實色澤，從而延長鮮杏的貯藏時間[10]。目前，大多數(shù)的果品“個性化”包裝都是采用充氮氣的方式，長時間冷鏈運輸也會出現(xiàn)脹袋、酒化、異味等問題。短時間氮氣處理會抑制果實衰老進(jìn)程，且氮氣包裝研究報道較少。真空預(yù)冷和N2處理雖然能延緩新鮮果蔬的成熟衰老進(jìn)程，改善貯藏品質(zhì)，但其在延緩杏果實衰老的問題上研究不夠深入。近年來，將真空預(yù)冷和氣調(diào)熏蒸保鮮技術(shù)結(jié)合的采后果蔬處理方式在國內(nèi)外受到了廣泛關(guān)注。因此，本研究擬采用真空預(yù)冷結(jié)合N2包裝的方法，對小白杏進(jìn)行采后處理，研究真空預(yù)冷結(jié)合N2處理方式對杏果實采后品質(zhì)及活性氧相關(guān)酶活性的影響，為真空預(yù)冷結(jié)合N2熏蒸處理方式在杏果實采后保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠熟期小白杏(總可溶性固形物≥12.18%)于2020年5月采自新疆庫車縣小白杏種植基地。挑選無病蟲害、無機(jī)械損傷，且大小、顏色、外觀一致的小白杏，利用真空預(yù)冷機(jī)將果心溫度預(yù)冷至4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、冰醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；聚乙二醇-6000、聚乙烯吡咯烷酮、鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.1 試驗儀器

P902型電導(dǎo)率儀，上海佑科儀器儀表有限公司；UV-2600型紫外分光光度計，日本島津公司；A11型研磨機(jī)，廣州IKA實驗室技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將氣調(diào)包裝機(jī)的氣調(diào)比例調(diào)到100% N2，通過O2和CO2檢測器測量確定保鮮盒中的O2濃度≤0.05% (體積分?jǐn)?shù))。將預(yù)冷后的果實放入保鮮盒中(每盒20個)，進(jìn)行氣調(diào)包裝。用激光打孔機(jī)分別于2、4、6 h后打孔，貯于10 ℃恒溫箱中，每隔3 d測定各項生理指標(biāo)。杏果實用液氮凍樣后，放入-40 ℃冰箱貯存。真空預(yù)冷4 ℃、真空預(yù)冷4 ℃結(jié)合N2熏處理2 h分別表示為CK、N2。

1.3 指標(biāo)測定方法

1.3.1 硬度的測定

參考曹建康等[11]的方法，每盒隨機(jī)選擇15個杏果，圍繞果實的赤道部位，間隔等距離的3個位置，各削去果皮(厚約1 mm)，用GY-4型果實硬度計測定各個位置果肉的硬度，重復(fù)3次。最終結(jié)果以平均值計，單位為N。

1.3.2 呼吸強(qiáng)度的測定

采用Check Point 3便攜式頂空分析儀測定。

1.3.3 乙烯釋放量的測定

參照HU等[12]的方法，稱取5.0 g鮮杏放入到密封的玻璃器皿中，在(20±1) ℃條件下靜置2 h，抽取1.0 mL氣體進(jìn)行乙烯含量的測定。乙烯釋放量的單位為μL/(kg·h)。

1.3.4 維生素C含量的測定

稱取10.0 g果蔬樣品置于研缽中，加入少量20 g/L 的草酸溶液，在冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入到100 mL容量瓶中，用20 g/L的草酸溶液定容至刻度，搖勻、提取10 min后，過濾收集溶液備用。用移液管吸取10.0 mL濾液置于100 mL的三角瓶中，用已標(biāo)定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至微紅，且15 s不褪色。同時，以10 mL 20 g/L的草酸溶液作為空白按同樣方法進(jìn)行滴定。重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞膜透性的測定

采用電導(dǎo)率儀法[13]進(jìn)行測定，電導(dǎo)率計算如公式(1)所示：

(1)

1.3.6 丙二醛含量的測定

丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的測定參考曹建康等[11]的方法。稱取1.0 g果蔬樣品，加入5.0 mL 10%體積分?jǐn)?shù)三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)溶液，研磨勻漿后，于4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，收集上清液。取2.0 mL上清液(對照空白管中加入2.0 mL 10%TCA溶液代替提取液)，加入2.0 mL 0.67%(體積分?jǐn)?shù))硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)，混合后在沸水浴中煮沸20 min， 取出冷卻后再次離心。分別測定上清液在450、532和600 nm處的吸光度值。重復(fù)3次。

1.3.7 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的測定

參照曹建康等[11]的方法，以1 min 1 g果蔬組織(鮮重)產(chǎn)生的超氧陰離子的物質(zhì)的量作為超氧陰離子的產(chǎn)生速率，表示為nmol/(min·g)。

1.3.8 H2O2含量的測定

參照VELIKOVA等[14]的方法，稍作修改。稱取1.0 g果蔬樣品，加入1 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))TCA溶液進(jìn)行提取，于4 ℃、8 000 r/min 離心20 min，收集上清液。取0.5 mL上清液并加入1 mL KI溶液和0.5 mL 磷酸緩沖液。記錄390 nm處的吸光度值，將其表示為μmol/kg。

1.3.9 酶液的提取

參照ALI等[15]的方法，稍作修改。取5.0 g冷凍組織于5 mL磷酸鹽溶液(pH 5.5)中研磨勻漿，8 000 r/min 離心15 min，收集上清液，測定過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活力。

1.3.10 POD活性的測定

POD活性的測定參照PARAFATI等[16]的方法，稍加修改。向試管中加入3 mL磷酸緩沖溶液(pH 7.8， 50 mmol/L)、220 μL 0.3%(體積分?jǐn)?shù))愈創(chuàng)木酚和20 μL粗酶液。加入0.3%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液后立即在470 nm下測定2 min內(nèi)吸光度值的變化。1單位的POD酶活定義為1 min內(nèi)吸光度值增加0.01，其結(jié)果表示為U/g。

1.3.11 CAT活性的測定

CAT活性的測定參照曹建康等[11]的方法，稍作修改。向試管中加入100 μL粗酶和2.9 mL 20 mmol/L 過氧化氫溶液。15 s后記錄反應(yīng)體系在240 nm處的吸光值，作為初始值，然后每隔30 s記錄1次，連續(xù)測定6個數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。以1 g克鮮重1 min 吸光度變化值減少0.01為1個過氧化氫酶活性單位，用U/g表示。

1.3.12 SOD活性的測定

SOD活性的測定參照參照曹建康等[11]的方法，以每分鐘每克果蔬組織(鮮重)的反應(yīng)體系對氮藍(lán)四唑(yingwenquancheng，NBT)光化還原的抑制為50%為1個超氧化物歧化酶活性單位，用U/g表示。

1.3.13 PPO活性的測定

PPO活性的測定參照PAN等[17]的方法，稍加修改。向試管中加入4 mL磷酸緩沖溶液(50 mmol/L)、0.1 mL 粗酶液、0.9 mL 鄰苯二酚(50 mmol/L)。以蒸餾水為參比空白，15 s后記錄在420 nm處的吸光值，作為初始值，然后每隔30 s記錄1次，連續(xù)測定6個 數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。將單位PPO酶活性定義為在420 nm 每分鐘吸光度增加0.01單位，PPO活性表示為U/g。

1.3.14 APX活性的測定

APX活性的測定參照曹建康等[11]的方法，稍加修改。向試管中加入磷酸鉀緩沖液(50 mmol/L，pH 7.3)、 1 mmol/L還原型抗壞血酸、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L過氧化氫溶液和0.1 mL上清液。1個酶活單位定義為在290 nm下混合液吸光度變化0.01，抗壞血酸過氧化物酶活性表示為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及利用Duncan法來比較均值。P≤0.05 表示差異顯著，P≤0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2處理對小白杏硬度的影響

在貯藏期間，小白杏果實的硬度呈現(xiàn)出逐漸減小的變化趨勢(圖1)。貯藏至第6天，N2處理的硬度為6.65 N，高于對照組38.35%。隨著貯藏時間的延長，經(jīng)真空預(yù)冷結(jié)合N2處理后的小白杏果實硬度顯著(P<0.05)高于對照組杏果實的硬度，說明N2處理能夠較好地保持小白杏的硬度。

圖1 N2處理對小白杏硬度的影響

2.2 N2處理對小白杏呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量的影響

呼吸作用是果蔬采后的重要生理活動，其強(qiáng)度越大，果蔬內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)消耗越多，品質(zhì)下降越快[18]。由圖2-a可知鮮杏在貯藏過程中呼吸強(qiáng)度先上升后下降，其中N2能抑制小白杏果實的呼吸強(qiáng)度并能延緩呼吸高峰的出現(xiàn)。CK在第9天時達(dá)到呼吸高峰，最大值為81.61 mg/(kg·h)，N2處理組在第12天時達(dá)到呼吸高峰，最大值為65.37 mg/(kg·h)。與對照組相比，N2處理能顯著抑制小白杏的呼吸強(qiáng)度(P<0.05)。

在貯藏過程中杏果實的乙烯釋放量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，由圖2-b可知，CK組在貯藏第9天時達(dá)到乙烯釋放高峰，其中對照組乙烯釋放速率高于處理組。N2在貯藏第12天時達(dá)到乙烯高峰，對照組乙烯釋放量是N2處理組的1.15倍。因此，N2處理不僅能延緩杏果實乙烯高峰的出現(xiàn)還能顯著降低乙烯的釋放速率(P<0.05)。

a-呼吸強(qiáng)度；b-乙烯釋放量

2.3 N2處理對小白杏維生素C含量的影響

維生素C是果蔬重要的營養(yǎng)成分之一，同時也是果實內(nèi)活性氧的重要抗氧化劑[19]，可有效地保護(hù)細(xì)胞組織免受損害從而延緩果蔬衰老的速度[20]。隨著呼吸作用和自身的氧化消耗，維生素C含量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(圖3)。貯藏至第15天，CK組與N2處理組的含量分別為10.40、12.07 mg/100g。在整個貯藏期間，處理組明顯高于對照組(P<0.05)。由此可知，N2處理可以有效保持小白杏果實的營養(yǎng)成分。

圖3 N2處理對小白杏維生素C含量的影響

2.4 N2處理對小白杏細(xì)胞膜透性的影響

細(xì)胞膜透性在一定程度上反映了細(xì)胞受傷害和果品的衰老程度[21]。隨著貯藏時間的延長，杏果實采后細(xì)胞膜透性持續(xù)上升(圖4)，而N2處理組杏果實的細(xì)胞膜透性顯著低于CK組(P<0.05)，貯藏至第18天時，細(xì)胞膜透性分別是74.71%、64.02%，與CK相比，N2處理在一定程度上降低了細(xì)胞膜透性，延緩了果實的衰老。因此，N2處理有利于保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而抑制果實中細(xì)胞膜透性的增加。

圖4 N2處理對小白杏細(xì)胞膜透性的影響

2.5 N2處理對小白杏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響

MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，能反映細(xì)胞膜脂過氧化程度，其含量的積累會對果蔬細(xì)胞造成氧化損傷[22]。由圖5可知，鮮杏在貯藏的前15 d， MDA含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，但N2處理組顯著低于CK對照組(P<0.05)。貯藏至15 d，真空預(yù)冷結(jié)合N2處理組杏果實的MDA含量是對照組的71.36%。所以，N2處理能顯著抑制MDA含量的積累(P<0.05)。

圖5 N2處理對小白杏MDA含量的影響

2.6 N2處理對小白杏超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和過氧化氫含量的影響

超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和過氧化氫含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(圖6)。貯藏至12 d時，N2處理組、CK組超氧陰離子產(chǎn)生速率分別為27.78、37.02 nmol/(min·g)，過氧化氫含量分別為42.64、19.32 μmol/kg。在整個貯藏期間，N2處理組杏果實的超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率、過氧化氫含量顯著低于CK組(P<0.05)。

a-超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率；b-過氧化氫含量

2.7 N2處理對小白杏活性氧代謝相關(guān)酶活性的影響

在整個貯藏期間，處理組和對照組POD的活性呈現(xiàn)出先上升后下降再上升的趨勢(圖7)。對照組與N2處理組酶活性分別在第9天、第12天達(dá)到最大值，分別為1.45、2.01 U/g。N2處理顯著(P<0.05)提高POD活性，在整個貯藏期間POD都相對穩(wěn)定，并處于較高的活性水平。

CAT、APX活性呈現(xiàn)逐漸減小的變化趨勢。由圖7可知，在整個貯藏期間N2處理組CAT、APX活性始終高于對照組，第9天時N2處理組CAT、APX活性分別是對照組的1.39倍、1.46倍，N2處理能夠延緩CAT、APX活性的降低。

SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，由圖7可知，N2處理組的SOD活性始終高于對照組。對照組與N2處理組SOD活性分別于第9天、第12天達(dá)到最大值，分別為1.06、1.41 U/g。N2處理能夠延緩SOD活性高峰的出現(xiàn)。

貯藏0～12 d對照組果實多酚氧化酶活性逐漸升高，之后逐漸下降。如圖7所示，N2處理組中的多酚氧化酶酶活性在貯藏0～15 d呈上升趨勢，隨后呈下降趨勢。第15天時，處理組比對照組多酚氧化酶活性高24.03%。與N2處理組相比，對照組在整個貯藏時間內(nèi)均保持較高的酶活性。

a-POD；b-CAT；c-SOD；d-PPO；e-APX

3 討論

MDA含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)[23]，果實硬度逐漸下降，細(xì)胞膜透性增加，直接影響了果實的耐貯性和商品率[24]。本試驗中對照組MDA含量隨著貯藏時間的延長不斷升高且顯著高于處理組，說明貯藏期間細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度不斷升高，細(xì)胞膜受到的傷害逐漸加劇。在N2處理條件下，高抗氧化酶活對減輕膜脂過氧化有積極的作用，能有效減緩杏果實中MDA含量的積累和細(xì)胞膜透性的增加。

果蔬的品質(zhì)下降、貨架期縮短與H2O2密切相關(guān)，過氧化氫的增加會導(dǎo)致膜不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生更高的MDA[25]。在本文中N2處理能有效抑制小白杏貯藏期間MDA、H2O2含量的增加及超氧陰離子自由基生成速率。N2處理組中活性氧積累的減少與MDA含量的降低相一致，表明N2處理可能通過抑制活性氧的積累來防止膜過氧化。

杏果實的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量是一系列酶相互作用的結(jié)果，N2處理通過抑制相關(guān)酶活性來降低杏果實的呼吸作用。杏果實在呼吸作用下產(chǎn)生大量呼吸積熱，促使小白杏內(nèi)部溫度升高，加速果實失水，導(dǎo)致品質(zhì)劣變。因此，N2處理能顯著(P<0.05)抑制小白杏果實在貯藏過程中呼吸強(qiáng)度的升高，較好地保持鮮杏品質(zhì)。在本研究中，POD活力的變化趨勢與果實呼吸強(qiáng)度變化趨勢一致，表明POD活力與呼吸強(qiáng)度、乙烯的生物合成以及細(xì)胞衰老密切相關(guān)。在桃[26]、藍(lán)莓[27]和甜櫻桃[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，提高抗氧化能力能消除活性氧的過量產(chǎn)生，延緩果實衰老進(jìn)程。CAT、SOD和APX是活性氧清除的關(guān)鍵酶，能清除活性氧，防止活性氧的積累[29]。N2處理能促進(jìn)抗氧化酶SOD活力增加、延緩CAT、APX活力的降低、維持活性氧代謝平衡、抑制呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量、誘導(dǎo)抗氧化酶活力、抑制自由基的累積、維持細(xì)胞的穩(wěn)定，延緩小白杏果實采后衰老進(jìn)程。

4 結(jié)論

小白杏果實的衰老與活性氧代謝密切相關(guān)。真空預(yù)冷結(jié)合N2熏蒸通過提高PPO、POD、SOD、CAT、APX活性，延緩呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，從而抑制果實硬度的下降和細(xì)胞膜透性的增加，延緩杏果實的衰老。因此，真空預(yù)冷結(jié)合N2處理技術(shù)作是一種安全有效、便于應(yīng)用的保鮮方式，可為小白杏采后保鮮貯藏及提高果實物流品質(zhì)提供理論和技術(shù)支持。