基于核酸適配體-SYBR GreenⅠ快速檢測金剛烷胺的熒光傳感技術

呂辰，李鈺金，宋明燕，吳世嘉，段諾*，王周平*

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)2(中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島，266003)

金剛烷胺是母體結構為飽和三環癸胺的氨基衍生物，常以鹽酸鹽形式存在，能在較低濃度下抑制甲型流感病毒的復制[1]。長期服用金剛烷胺類抗病毒藥物易導致流感類病毒產生抗藥性，且增加流感類病毒變異的可能性[2-3]。殘留在畜禽動物體內的金剛烷胺可通過食物鏈損傷人體健康[4]。中國農業部于2005年12月、美國食品藥品監督管理局于2006年先后禁止對禽畜使用金剛烷胺類抗病毒藥物。但仍有小部分養殖戶為經濟利益而向飼料中非法添加此類藥物，嚴重威脅了消費者的健康和畜牧業的發展[5-6]。

我國對金剛烷胺的檢測方法包括色譜分析法、酶免疫法、分子印跡電化學傳感器技術、熒光探針技術等。其中，色譜分析法和酶免疫法較為典型[7]。色譜法包括高效液相色譜法、氣相色譜法、高效液相串聯質譜法、氣相色譜串聯質譜法等[8-10]；酶免疫法包括酶聯免疫吸附測定法和化學發光免疫分析法等[11-13]。這2類方法雖然常用，但也存在一定的弊端：色譜分析法樣品處理繁瑣耗時，檢測設備昂貴，需要專業的技術人員操作，現場檢測中具有局限性；酶免疫法靈敏度和準確度較低，過程繁瑣、耗時，成本高，制備出的抗體也易受溫度等環境因素的影響。

核酸適配體是與靶標具有高親和力、高特異性的RNA或單鏈脫氧核糖核酸(ssDNA)[14]，可經設計后通過體外篩選技術得到[15]，它可與靶標通過非共價鍵作用相互結合，形成復雜的三維結構從而特異性識別靶標[16]。核酸適配體相對分子質量小、性質穩定，本身不帶有信號，需經過化學修飾后通過信號轉換使得結果可視化。利用篩選得到的核酸適配體構建生物傳感器，可廣泛應用于安全檢測領域[17-21]。目前，基于核酸適配體進行金剛烷胺檢測的方法未見報道，本文利用SYBR Green I(SGI)熒光染料結合適配體傳感技術，將適配體與金剛烷胺的識別過程轉化為熒光信號，建立基于核酸適配體-SYBR Green I快速檢測金剛烷胺的熒光傳感技術。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

氯化鈉、氯化鉀、三氯乙酸，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；適配體ssDNA序列，上海生工生物工程技術服務有限公司；鹽酸金剛烷胺(分析純)，美國Sigma-Aldrich公司；SGI賽默飛世爾科技(中國)有限公司；超純水，18.2 mΩ，由美國Millipore超純水儀制備；牛奶樣品，購于無錫歐尚超市。

1.1.2 儀器與設備

Synergy H1型多功能酶標儀，美國伯騰公司；Centrifuge 5424R臺式高速冷凍離心機，德國艾本德公司；KQ-800DE超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；AR224CN型電子天平，奧豪斯儀器中國有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 檢測原理

SGI是一種熒光染料，游離狀態下在497 nm光的激發下，在530 nm處可發射出微弱的熒光[22]，當體系中有DNA適配體存在時，SGI可嵌入DNA折疊結構從而使得熒光發射強度擴大1 000倍，而當向體系中加入目標物金剛烷胺后，金剛烷胺與適配體的特異性結合會導致SGI染料脫離適配體的嵌合，從而引起體系中熒光強度的降低，其原理如圖1所示。因此，可以利用SGI作為信號指示劑，通過熒光的強度變化實現對金剛烷胺的定量檢測。

圖1 基于適配體-SGI染料檢測金剛烷胺原理圖

1.2.2 SGI-適配體結合時間的優化

向1×SGI溶液中加入終濃度為0.1 μmol/L的適配體，將SGI與適配體的結合時間分別設置為2、4、6、8、10 min，保持其他條件不變，利用多功能酶標儀在497 nm下，測定不同結合時間下SGI-適配體溶液在530 nm處的熒光強度。

1.2.3 適配體-金剛烷胺孵育時間的優化

將1×SGI及終濃度為0.1 μmol/L適配體混合溶液均勻分裝至2組：A組為含有1 μmol/L金剛烷胺的實驗組；B組為加入結合緩沖液替代A組中金剛烷胺的空白對照組。實驗組與對照組均在常溫下進行孵育，并將孵育時間設置為2、5、10、15、20、25 min，孵育結束后分析不同孵育時間下對照組與實驗組的熒光強度差值。

1.2.4 金剛烷胺的定量檢測

將1×SGI染料及終濃度為0.1 μmol/L適配體溶液混合均勻后分為2組：A組為加有金剛烷胺的實驗組；B組為加入結合緩沖液替代金剛烷胺的空白對照組。將適配體-SGI混合溶液均勻分裝至2組后，向實驗組適配體-SGI混合體系中加入金剛烷胺配制成一定的質量濃度梯度(0.000、1.000、10.000、50.000、75.000、100.000 ng/mL)，將對照組和實驗組在室溫下孵育10 min后測定熒光強度。以金剛烷胺的濃度為橫坐標，以對照組與實驗組的熒光強度差值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5 加標回收實驗

利用實驗設計方法對動物源食品牛奶進行加標回收實驗，將2 mL的牛奶樣品稀釋后加入標準品金剛烷胺，并設置以結合緩沖液替代標準品為空白對照組。分別加入1%(質量分數)的三氯乙酸后渦流混合均勻，將混合體系超聲、離心、去沉淀后用0.22 μm的濾膜進行過濾收集。用實驗設計方法進行檢測，將對照組和實驗組的熒光強度差值帶入標準曲線得到檢測值并計算回收率。

2 結果與分析

2.1 可行性驗證

為了驗證該檢測方法的可行性，分別測定SGI溶液、SGI-適配體溶液、SGI-金剛烷胺溶液、SGI-適配體-金剛烷胺溶液的熒光光譜，結果如圖2所示。可見，SGI本身發射的熒光非常微弱；當溶液中只存在SGI和金剛烷胺時，也幾乎不發射熒光，說明金剛烷胺不會導致溶液熒光強度的變化；在SGI-適配體復合體系中，溶液在530 nm處熒光強度發生顯著升高；當SGI-適配體復合體系中加入金剛烷胺后，由于適配體對于金剛烷胺的特異性識別作用，導致整個體系的熒光強度發生明顯降低。因此表明，SGI對適配體和金剛烷胺有著較好的響應，可以引起溶液的熒光強度發生較大幅度的變化，方法可行。

圖2 檢測方法的可行性驗證

2.2 SGI-適配體結合時間的優化

SGI和適配體結合會顯著增強熒光強度，但是SGI-適配體能否充分結合以及結合后的熒光穩定性仍未可知，為了探究SGI-適配體結合時間對實驗的影響，對SGI與適配體的結合時間進行優化。由圖3可知，當向SGI溶液中加入適配體2 min后即可觀察到熒光信號發生較強響應，并且隨著時間的增加，熒光強度基本無變化，表明SGI和適配體的結合幾乎是即時發生的，較為快速和穩定，因此選用2 min為SGI與適配體的最佳結合時間，并用于后續實驗。

圖3 結合時間的優化

2.3 適配體-金剛烷胺孵育時間的優化

適配體和金剛烷胺孵育時間的長短會影響檢測的效率，因此需對適配體-金剛烷胺孵育時間進行優化。結果如圖4所示，孵育0～10 min時，隨著時間的延長，對照組與實驗組在530 nm處熒光強度的差值逐漸上升，在孵育時間為10 min時，熒光強度的差值達到最大，并且隨著時間的延長熒光強度的差值不會繼續增加。說明10 min時金剛烷胺引起的熒光變化已達到飽和，而且孵育時間過長會降低檢測的效率，因此10 min為適配體和金剛烷胺的最佳孵育時間。

圖4 孵育時間的優化

2.4 金剛烷胺的定量檢測

在優化的最佳實驗條件下，利用SGI熒光染料的特性，探究不同濃度金剛烷胺與熒光強度變化之間的關系。由圖5可知，金剛烷胺質量濃度在1～100 ng/mL 時，熒光強度的差值(y)與金剛烷胺質量濃度(x)呈良好的線性關系，隨著金剛烷胺濃度的增加，體系熒光強度差值也同比增加，校正后的線性方程為：y=51.31x+156.75(R2=0.992 5)，最低檢出限(S/N=3)為0.84 ng/mL。

圖5 不同質量濃度金剛烷胺熒光光譜圖及金剛烷胺濃度與熒光強度差值的關系曲線

2.5 加標回收實驗

為探究該方法在實際樣品檢測中的實用性，對牛奶樣品進行了加標回收實驗，結果如表1所示，加標回收實驗的回收率在93.22%～104.86%，說明該方法較好的準確性，因此可用于實際樣品的檢測。

表1 牛奶樣品的加標回收率

2.6 特異性驗證

為驗證該方法對于金剛烷胺的特異性，向檢測體系中加入相同濃度的金剛烷胺結構類似物及共存物(金剛乙胺、美金剛胺、阿昔洛韋、利巴韋林以及嗎啉雙胍)，在最優條件下進行實驗，并對各個物質引起的熒光強度的差值與金剛烷胺引起的熒光強度差值的比率進行比較，如圖6所示，金剛烷胺引起的熒光強度變化遠遠高于其他5種物質，表明該檢測方法對于金剛烷胺具有良好的特異性。

圖6 檢測方法特異性

3 結論

利用SYBR Green I熒光染料與核酸適配體構建了一種快速檢測金剛烷胺的熒光傳感技術。相對于傳統的色譜分析法和酶免疫法，該方法無需化學標記，選用的適配體易于制備，檢測過程操作簡便、耗時短、效率高，檢測方法特異性強，且在實際樣品的檢測中表現出較高的靈敏度，說明其在食品安全檢測中具有實用性。本研究方法為食品中金剛烷胺獸藥殘留的檢測提供了參考，同時也為構建食品中其他小分子危害物的檢測方法提供了思路。