電化學傳感器在赭曲霉毒素A檢測中的應用研究進展

高棟，陳秀金,2*，李兆周,2，王耀,2，何凱鋒，王靜，黃正迪，孫鳳霞

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471000) 2(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽，471000) 3(石河子大學 食品學院，新疆 石河子，832003)

赭曲霉毒素A (ochratoxin A，OTA) 是一種由曲霉屬和青霉屬的某些產毒菌株產生的次級代謝產物,是已知的6種赭曲霉毒素中毒性最強的一種，廣泛存在于咖啡、啤酒、紅酒、玉米、小麥、燕麥和蔬菜中[1]。毒理學研究表明，OTA被人體吸收后，對人體腎臟和肝臟有強烈的毒性，同時具有免疫抑制、致癌、致畸和致突變作用[2], 對人體健康造成嚴重威脅。因此，對食品中的OTA含量進行檢測具有重要意義。為了更好地監控食品中的OTA含量，世界各國規定了OTA在食品及谷物等農產品中的限量標準，如歐盟委員會規定供幼兒食用的谷類食品中OTA限量0.5 μg/kg，葡萄汁和葡萄酒中OTA限量2 μg/kg，谷物加工食品中OTA限量3 μg/kg，原始谷物和焙烤咖啡中OTA限量5 μg/kg 和干果中OTA限量10 μg/kg[3-4]。同時，我國也制定了食品及其原料中OTA含量的限量標準，如葡萄酒中OTA限量2 μg/kg，谷物及其制品、大豆和咖啡中OTA限量5 μg/kg[5]。

現用于檢測食品及農產品中OTA含量的方法有儀器分析法、膠體金側流層析法和電化學傳感器。儀器分析法包括高效液相色譜法、液相色譜-質譜法、超高效液相色譜-熒光法、超高效液相色譜-電噴霧電離串聯質譜聯用法、氣相色譜-質譜法等。盡管這些方法靈敏度和準確性高，但檢測時需要專業人員操作昂貴的大型儀器，而且制備樣品的過程復雜。膠體金側流層析法不需要大型儀器檢測，操作簡單，可用肉眼直接對結果進行判定。但膠體金弱的光學性能以及低的生物分子結合率導致其靈敏度偏低[6]，影響了其在OTA快速檢測中的應用和發展。而電化學傳感器具有便攜、快速和經濟的優勢，可以彌補上述方法的缺點，目前已用于食品及農產品中OTA含量的檢測。因此，本文對電化學傳感器在OTA檢測中的應用研究進展進行了綜述，以期為開發OTA檢測新方法提供理論支撐。

1 電化學傳感器

電化學傳感器主要是基于待測物的電化學性質將待測物的化學量轉為電學量，然后對其進行檢測的一種傳感器。其工作原理就是將化學復合材料或生物活性物質固定在電極表面，利用其對分析物的特異性進行識別，識別信息經電極傳遞給信息轉換部分，然后被轉換成檢測信號，最后根據特異性識別前后電信號的變化量，對分析物進行定性和定量分析[7]。與其他傳統的檢測分析方法相比，電化學傳感器具有便攜、選擇性好、靈敏度高及可進行現場檢測的優勢。

2 電化學傳感器在OTA檢測中的應用

電化學傳感器按照修飾材料或識別活性物質的不同分為電化學免疫傳感器、分子印跡電化學傳感器、電化學適配體傳感器和其他電化學傳感器4種類型。

2.1 電化學免疫傳感器

電化學免疫傳感器是一種將免疫分析技術與電化學檢測技術相結合建立的傳感檢測方法[8]。其主要工作原理是通過固定在電極表面上的抗體對抗原進行特異性識別，將抗原濃度轉化為電信號，再對電信號進行處理以數字的方式呈現檢測結果，從而對目標物進行定量檢測[9]。在電化學免疫傳感器中, 抗體作為識別元件，其固定化方法、固定量和抗體活性均會影響傳感器性能。該方法的優點在于抗原與抗體的特異性識別，避免了檢測過程中的非特異性干擾。

根據是否對免疫分子標記電化學免疫傳感器可分為標記型和無標記型2種。標記型電化學免疫傳感器在檢測前需要對抗體進行標記，操作步驟較多，檢測過程較復雜。如LIU等[10]構建了一種間接競爭法檢測OTA的電化學免疫傳感器，該傳感器用堿性磷酸酶標記抗體，檢測范圍為1.00～1.00×103ng/mL，檢測限低至2.00×10-1ng/mL，具有良好的重現性和高選擇性。而無標記型電化學免疫傳感器是直接檢測抗原抗體反應時造成的電學量變化，極大地簡化了操作過程。如MALVANO等[11]開發了一種基于絲網印刷碳電極的無標記電化學免疫傳感器，并將其用于紅酒中OTA的定量檢測。試驗將OTA抗體修飾到絲網印刷電極表面，采用循環伏安法對修飾電極進行表征，運用阻抗法對紅酒中OTA的含量進行檢測。優化條件下，該傳感器在3.00×10-1～20 ng/mL范圍內可對OTA進行準確快速的檢測，檢測限2.50×10-1ng/mL。KNENE等[12]建立了一種對咖啡中OTA含量檢測的無標記電化學免疫傳感器，檢測范圍5.00×10-1～20 ng/mL， 檢測限9.60×10-2ng/mL。與標記型電化學免疫傳感器相比，無標記型電化學免疫傳感器的檢測范圍較小，但其無需對抗體進行標記，操作更簡便。

近年來，金納米粒子、碳納米材料、磁性納米粒子和納米雜化材料已用于電化學免疫傳感器中，這些納米材料為固定抗體提供了良好的生物相容性表面，提高了檢測靈敏度[13]，其中磁性納米粒子和金納米粒子用于檢測OTA的電化學免疫傳感器，如ZHANG等[14]研制了一種基于磁性納米粒子的電化學免疫傳感器，該研究結合酶聯免疫吸附法對OTA含量進行檢測，檢測范圍為1.00×10-2～8.20×10-1ng/mL，檢測限7.00×10-3ng/mL。選擇谷物和飼料樣品進行添加回收試驗，結果表明，加標回收率為78.7%～113.5%，相對標準偏差在3.60%～9.8%，變異系數小于15%。HOU等[15]開發了一種基于噬菌體展示模擬表位肽的超靈敏電化學免疫傳感器，以OTA模擬表位肽作為識別元件，用金納米粒子修飾玻碳電極，構建檢測OTA的電化學免疫傳感器，檢測范圍為7.17×10-6～5.49×10-4ng/mL，檢測限2.04×10-6ng/mL；對玉米樣品和啤酒樣品進行添加回收試驗，回收率分別為89.6% ～107.4%和99.3%～104.3%。和傳統的OTA電化學免疫傳感器(檢測限8×10-2ng/mL)相比[16]，基于磁性納米粒子構建的OTA電化學免疫傳感器靈敏度提高了近9倍。與磁性納米粒子的信號放大相比，基于金納米粒子的OTA電化學免疫傳感器的信號放大效果更好，其靈敏度提高了近300倍。綜上，用磁性納米粒子和金納米粒子均可提高OTA電化學免疫傳感器的靈敏度。基于金納米粒子電化學免疫傳感器的靈敏度提高可能是因為金納米粒子具有良好的導電性，修飾到電極上提高了電子傳遞速率，從而提高電化學免疫傳感器靈敏度。磁性納米粒子提高傳感器的靈敏度可能是因為磁性納米粒子具有類似過氧化物酶的催化性能[17]，故在電化學免疫傳感器中可作為催化劑，加快反應速度，從而使傳感器的靈敏度得到提高。相比之下，基于金納米粒子構建的電化學免疫傳感器檢測范圍更寬，檢測限更低。

2.2 分子印跡電化學傳感器

分子印跡電化學傳感器是一種將分子印跡技術和電化學傳感技術相結合的分析方法。分子印跡技術是指制備能識別目標分子聚合物的技術[18]。所制備的聚合物作為分子印跡電化學傳感器的識別元件，具有專一性強，穩定性高，可重復使用，檢測靈敏，成本低，同時還克服了電化學檢測方法受雜質干擾的不足[19]。近年來，研究者還通過引入各種納米材料來進一步提高分子印跡電化學傳感器的檢測性能，現用于電化學傳感器的納米材料有碳納米材料、金屬納米材料、磁性納米材料、金屬氧化物以及復合納米材料[20]，其中用于檢測OTA分子印跡電化學傳感器的納米材料有多壁碳納米管和銀納米粒子。

多壁碳納米管比表面積大，穩定性好，具有良好的生物相容性和導電性，在分子印跡電化學傳感器中，其作為良好的載體材料和印跡基質用于修飾電極[20-21]，能提高OTA分子印跡電化學傳感器的靈敏度。如PACHECO等[22]用多壁碳納米管和分子印跡聚合物修飾玻碳電極，用OTA印跡的聚吡咯作為識別元件，制備了檢測OTA含量的分子印跡電化學傳感器，原理如圖1所示。檢測范圍為2.02～4.04 ng/mL， 檢測限1.70 ng/mL。在啤酒和葡萄酒樣品中檢測的加標回收率為84%～104%，相對標準偏差在4.2%～7.5%。

圖1 基于多壁碳納米管的分子印跡傳感器原理圖

銀納米粒子用于分子印跡電化學傳感器能夠增加電極的比表面積，增強識別位點與電化學換能器之間的電子傳遞速度，從而放大分子印跡電化學傳感器的檢測信號[20]。然而，銀納米粒子單獨修飾電極穩定性差，往往需要與其他材料相結合，形成雜化銀納米粒子，摻入分子印跡膜提高分子印跡電化學傳感器靈敏度。YOLA等[23]設計了一種基于銀納米粒子的分子印跡電化學傳感器，用于葡萄汁和葡萄酒樣品中OTA的檢測，試驗原理見圖2。該分子印跡電化學傳感器摻雜多金屬氧酸鹽H3PW12O40和功能化的還原氧化石墨烯修飾玻碳電極，其中還原氧化石墨烯能加快傳感器的電子傳遞速率，提高傳感器的靈敏度。經優化，該傳感器在2.02×10-2～6.06×10-1ng/mL范圍內能對OTA進行靈敏的快速分析，檢測限低至6.46×10-3ng/mL。

圖2 基于還原氧化石墨烯分子印跡傳感器原理圖

和多壁碳納米管構建的OTA分子印跡電化學傳感器相比，銀納米粒子構建的傳感器檢測限更低，這可能是因為在銀納米粒子中摻雜金屬氧酸鹽和功能化的還原氧化石墨烯在增加電子傳遞速率的基礎上既克服了銀納米粒子修飾電極穩定性差的缺陷，又增大了電極的比表面積，同時還提高了反應過程中的催化性能，從而使OTA分子印跡電化學傳感器的靈敏度更高。

2.3 電化學適配體傳感器

適配體是通過指數富集配體系統進化技術從體外人工合成的單鏈核酸文庫中篩選出來的寡核苷酸片段[24],是由20～80個核苷酸組成的RNA或單鏈DNA，可以折疊構成熱力學穩定的三維結構，通過氫鍵、范德華力、靜電作用等與靶分子(如金屬離子、氨基酸、蛋白質、酶等)特異性結合[25]。適配體又被稱為“化學抗體”[24]，與傳統抗體相比，適配體的特異性強、靶物質范圍廣、易修飾、穩定性強且可在常溫下運輸、篩選周期短、易獲得和成本低。鑒于這些優勢，適配體已被廣泛地用作電化學傳感器的識別元件。根據工作方式不同可將其分為親合型、構型變換型和混合型3種類型。本文總結了電化學適配體傳感器在OTA檢測中的應用(表1)。

由表1可見，電化學適配體傳感器已廣泛的用于小麥、玉米、紅酒、白酒、葡萄酒、啤酒、咖啡等樣品中OTA含量的檢測。用于電化學適配體傳感器的納米材料有金屬納米材料、碳納米材料、金屬氧化物和復合納米材料等，其中金納米粒子、銀納米粒子、石墨烯和納米復合材料材料等用于OTA電化學適配體傳感器中。應用納米材料構建的大部分電化學適配體傳感器比未應用納米材料的電化學適配體傳感器檢測限低，如MAZAAFRIANTO等[30]設計了一種無標記的電化學適配體傳感器，在咖啡和啤酒樣品中的檢測限為7.83×10-2ng/mL；KAUR等[26]設計了一種基于石墨烯的電化學適配體傳感器用于葡萄汁中OTA的檢測，檢測限為1.00×10-7ng/mL。應用了石墨烯的電化學適配體傳感器檢測限低，可能是因為石墨烯具有良好的生物兼容性和導電性，同時還具有較大的比表面積[44]。同時還可以看出，在上述的納米材料中，金納米粒子應用較多，主要因為其具有良好的生物兼容性和導電性，制備過程簡單和粒徑可控優點[45]。另外，在電化學適配體傳感器中使用金納米粒子，檢測限更低，無論是單獨使用還是與其他納米材料組成納米復合材料使用，均可使電化學傳感器具有較低的檢測限，這主要取決于其具有良好的導電性和較大的比表面積。

表1 電化學適配體傳感器在OTA檢測中的應用

2.4 其他電化學傳感器

除了上述的三類電化學傳感器，還有研究者應用其他修飾材料或識別物質構建檢測OTA的電化學傳感器，如XIANG等[46]利用黑磷烯具有良好的電化學穩定性、電催化活性和優良的防垢性能等性質，設計了一種檢測OTA的電化學傳感器。采用微分伏安脈沖法對啤酒和葡萄汁中的OTA進行檢測，檢測范圍為3×102～1×104ng/mL，檢測限1.8×102ng/mL。DRIDI等[47]設計了一種基于熱裂解酶的電化學傳感器，對橄欖油中的OTA進行檢測。該方法對OTA濃度在8.08×10-1～40.38 ng/mL范圍呈現良好的線性關系，檢測限4.38×10-1ng/mL。AFZALI等[48]利用金納米顆粒的高比表面積、電催化和吸附特性，設計了一種選擇性強、操作簡單的電化學傳感器，該傳感器在谷類食品和啤酒樣品中的檢測范圍為2.02×10-1～40.38 ng/mL，檢測限為8.08×10-2ng/mL。JALALVAND[49]將石墨烯、多壁碳納米管、殼聚糖、離子液體、膠原-離子液體和氧化鎳納米材料結合在一起修飾玻碳電極，構建了一種用于果汁樣品中OTA檢測的電化學傳感器，其中膠原中含有大量的氧和氮原子，使其與金屬氧化物具有良好的親和力，避免了金屬氧化物納米粒子的聚集，提高了傳感器的穩定性，檢測范圍為4.04×10-3～4.04 ng/mL，檢測限2.02×10-3ng/mL， 該傳感器的重現性好且成本低。

3 展望

近年來，隨著各種納米材料或識別元件的應用，OTA電化學傳感器的靈敏度正在逐步改善，提高了OTA電化學傳感器的穩定性和重現性，但仍有一些性能需要繼續改進：(1)在電化學免疫傳感器中，抗原抗體在電極表面固載的穩定性仍需提高；(2)在分子印跡電化學傳感器中，功能單體種類單一，構建方法較為復雜；(3)開發無毒無害、價格低廉、生物兼容性更好的納米材料，如可開發新的納米復合材料，提高電化學傳感器的檢測性能。

電化學傳感器在OTA檢測中具有廣闊的應用前景，未來有取代傳統的檢測技術的潛力，因此，研發快速、靈敏、綠色、可用于現場檢測的電化學傳感器將是OTA檢測未來研究發展方向。