基于關(guān)鍵靶點及相關(guān)信號通路分析的四逆散治療腸易激綜合征分子作用機制的研究

李佳容，鄧海霞，陳更新

〔摘要〕 目的 通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接方法預(yù)測四逆散治療腸易激綜合征（IBS）的分子作用機制。方法 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選四逆散中所含藥物的活性成分，應(yīng)用GeneCards、DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫預(yù)測和篩選與IBS的相關(guān)靶點。采用Omicshare平臺對藥物靶點和疾病相關(guān)靶點進行匹配映射，獲得關(guān)鍵靶點。通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。借助Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物-化合物-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用GoEast數(shù)據(jù)庫對四逆散治療IBS的關(guān)鍵靶點進行GO分析，應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路分析。最后通過分子對接進一步驗證結(jié)果的可靠性。結(jié)果 通過篩選，得到123個活性成分，共涉及245個作用靶點，與疾病靶點相關(guān)的活性成分有89個，主要通過調(diào)控IL-6、TNF等靶蛋白及IBS炎癥過程中的Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路等發(fā)揮治療作用。分子對接結(jié)果顯示主要化合物與關(guān)鍵靶點具有較好的結(jié)合活性。結(jié)論 四逆散可能通過作用于免疫、炎癥系統(tǒng)相關(guān)的蛋白靶點及通路起到治療IBS的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 腸易激綜合征;信號通路;四逆散;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);靶點;分子對接

〔中圖分類號〕R259? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.11.015

Molecular Mechanism of Sini Powder in the Treatment of Irritable Bowel Syndrome

Based on the Analysis of Key Targets and Related Signal Pathways

LI Jiarong1， DENG Haixia2， CHEN Gengxin2*

（1. The Second Clinical School， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510405， China;

2. The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou， Guangdong 510120， China）

〔Abstract〕 Objective To predict the molecular mechanism of Sini Powder in treating irritable bowel syndrome （IBS） based on network pharmacology and molecular docking method. Methods The traditional Chinese medicine system pharmacology （TCMSP） was employed to screen the active ingredients of Sini Powder. GeneCards， DisGeNET and OMIM databases were used to predict and screen the disease-related targets of IBS. The Omicshare platform was employed to match the putative targets of ingredients and disease-related targets to obtain key targets. Then， protien-protien interaction network was constructed by using STRING database and the “medicine-chemical compound-targets-disease” network was constructed by using Cytoscape software. GoEast database was used to perform GO analysis on key targets of Sini Powder in the treatment of IBS， and DAVID database was used to perform KEGG pathway analysis. The reliability of the results was further verified by molecular docking. Results Through screening， 123 drug active ingredients were screened， involving a total of 245 targets and 89 of them related to IBS， mainly through the regulation of target proteins such as IL-6 and TNF and toll-like receptor signaling pathway and NF-κB signaling pathway in the process of IBS inflammation. The results of molecular docking showed that the main components had good binding with the key targets. Conclusion Sini Powder may play a role in the treatment of IBS through the role of immune， inflammation system related protein targets and pathways.

〔Keywords〕 irritable bowel syndrome; signal pathway; Sini Powder; network pharmacology; target; molecular docking

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome， IBS）是一種常見的功能性消化疾病，以反復(fù)腹痛和排便習(xí)慣改變?yōu)樘卣鳎０橛懈姑洝⒁钟舻劝Y狀。根據(jù)羅馬Ⅳ診斷標準，亞洲國家的IBS發(fā)病率為5%～10%，且女性患病率高于男性[1]。IBS發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)被廣泛認可的假說有胃腸道動力障礙、免疫與炎癥、內(nèi)臟超敏反應(yīng)、腦-腸軸功能紊亂、腸道菌群失調(diào)、遺傳易感性等，當前西醫(yī)治療手段有限，以基于癥狀的心理干預(yù)、飲食控制和藥物控制為主，但效果不顯著且易復(fù)發(fā)，而中醫(yī)辨證論治在IBS治療上有較大優(yōu)勢[2-3]。

IBS可根據(jù)其癥狀納入中醫(yī)學(xué)“泄瀉”“腸郁”“腹痛”“郁證”等范疇，多與先天不足或后天失養(yǎng)、情志不調(diào)、飲食失節(jié)有關(guān)[1]。四逆散是張仲景《傷寒論·辨少陰病脈證并治》中的名方，由柴胡、白芍、枳實、甘草四味中藥組成，其中，柴胡和甘草補脾體、疏肝氣;枳實和白芍宣暢氣機、散陰結(jié)，以達疏肝解郁、健脾止瀉之效。因其配伍得當，療效甚佳，在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療各種消化系統(tǒng)疾病[4]。有學(xué)者對四逆散治療IBS的綜合療效進行系統(tǒng)評價，分析結(jié)果顯示四逆散加減治療IBS的臨床療效優(yōu)于西醫(yī)常規(guī)療法[5]。動物實驗[6]發(fā)現(xiàn)，四逆散可以改善動物狀態(tài)和腸道功能，進而治療肝脾不調(diào)型IBS模型大鼠;還可通過降低腸道敏感性、降低血清5-羥色胺含量、改善胃腸電生理活動等機制治療內(nèi)臟高敏感性IBS模型大鼠。但目前關(guān)于四逆散治療IBS的相關(guān)研究多集中在臨床研究和動物實驗方面，分子水平的作用機制探討較為稀缺。

單味中藥或組方均具有多成分、多靶點、多途徑的作用特點，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)正是以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，從整體的角度系統(tǒng)地闡述疾病與藥物之間的關(guān)系以及藥物與機體之間相互作用的規(guī)律的研究方法。此外，從整體出發(fā)，更有利于全面揭示中藥及中藥方劑的藥理作用和分子機制。最后，通過分子對接了解化合物與靶點結(jié)合的方式及結(jié)合穩(wěn)定性，進一步驗證結(jié)果的可靠性[7]。本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接的方法，對四逆散治療IBS的成分及靶點進行整理和分析，為了解其作用機制提供更全面的認知和更系統(tǒng)的幫助。

1 方法

1.1? 藥物藥效成分及潛在作用靶點的收集

使用TCMSP平臺（https：//www.tcmsp-e.com/）收集柴胡、白芍、枳實、甘草4味中藥的化學(xué)成分，篩選口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18的化學(xué)成分作為四逆散中具有良好OB和DL的藥效成分，同時結(jié)合文獻研究及《中華人民共和國藥典》[8]對四逆散所含藥物中有明顯藥效成分的化合物進行補充，并分別找出這些成分對應(yīng)的作用靶點、將得到的作用靶點通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）以物種為“Homo sapiens”進行篩選，獲得與藥效成分化合物相關(guān)的潛在作用靶點的蛋白信息。若化合物及其靶點未被收錄在TCMSP中，則通過PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得SMILE格式，并導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）進行靶點獲取。

1.2? 疾病相關(guān)靶點的收集

以“irritable bowel syndrome”為關(guān)鍵詞，從DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、GeneCards（https：//www.genecards.org/）中查找IBS相關(guān)基因，其中，選取GeneCards數(shù)據(jù)庫所得結(jié)果中relevance score≥30（relevance score是該數(shù)據(jù)庫中用于評估基因與疾病相關(guān)性的指標，分數(shù)越大代表相關(guān)性越高）的基因納入此次分析，同時將這批基因與DisGeNET、OMIM數(shù)據(jù)庫所得結(jié)果進行合并，刪除重復(fù)和假陽性的基因，得到與IBS的相關(guān)靶點。

1.3? 潛在關(guān)鍵作用靶點的獲取

通過Omicshare平臺（https：//www.omicshare.com/），將四逆散藥效成分的潛在作用靶點和IBS的相關(guān)靶點進行匹配映射，并繪制韋恩圖獲得四逆散治療IBS的關(guān)鍵作用靶點。

1.4? 蛋白-蛋白相互作用（protein protein interaction， PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

把“1.3”中得到的關(guān)鍵作用靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），研究物種設(shè)定為人，獲得蛋白相互作用關(guān)系，將結(jié)果以PNG格式和TSV格式導(dǎo)出，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.2（http：//www.cytoscape.org）軟件制作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5? 藥物-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape構(gòu)建“藥物-活性成分-關(guān)鍵靶點-疾病”，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點代表四逆散、藥物活性成分的分子編碼、關(guān)鍵靶點、疾病;網(wǎng)絡(luò)中的邊用來連接方劑中的藥物與活性成分分子編碼、活性成分分子編碼與關(guān)鍵靶點、關(guān)鍵靶點與疾病。該網(wǎng)絡(luò)將藥物-化合物-靶點-疾病之間的關(guān)系可視化，并通過它剖析四逆散治療IBS的作用機制。

1.6? 關(guān)鍵靶點的通路注釋和可視化分析

將關(guān)鍵靶點通過GoEast（http：//omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/）進行GO富集分析;應(yīng)用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進行KEGG通路富集分析。GO分析結(jié)果包括生物學(xué)過程（biological process， BP）的內(nèi)容，取BP P值最小的10條條目制作氣泡圖。將KEGG富集分析結(jié)果取P值最小的30條通路繪制成氣泡圖。

1.7? 潛在活性成分-靶蛋白分子對接

為了進一步驗證靶點預(yù)測結(jié)果的可靠性及了解活性成分與靶蛋白的結(jié)合方式，對PPI網(wǎng)絡(luò)中連接度值排名較高的靶點與藥物-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中的重要化合物進行分子對接驗證。通過PubChem獲得化合物3D結(jié)構(gòu)的SDF文件，通過Open Babel 2.3.0軟件將其轉(zhuǎn)換為MOL2文件格式。通過SailVina 2.0軟件將對化合物批量進行加氫、加電荷、能量最小化等處理，并保存為PDBQT格式文件。通過PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）找到相應(yīng)靶點的PDB ID，并下載PDB文件，運用PyMOL 2.5軟件對靶蛋白中的進行去水、提取化合物等處理，通過插件獲取對接盒子參數(shù)，保存為PDB后綴的文件。運用AutoDockTools軟件給靶蛋白加氫、加電荷，轉(zhuǎn)成PDBQT文件。使用AutoDock Vina對化合物和靶蛋白進行對接。結(jié)合能小于0說明可以自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能的負絕對值越大，說明配體與受體的對接親合力越大，同時也說明小分子與受體結(jié)合的活性越高。把對接結(jié)果較好的靶蛋白和化合物通過PyMOL進行結(jié)合方式展現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1? 四逆散和IBS的相關(guān)靶點

綜合TCMSP數(shù)據(jù)庫、文獻研究及《中華人民共和國藥典》[8]檢索結(jié)果，從四逆散中檢索到130個藥效化合物，其中，柴胡13個，白芍8個，枳實17個，甘草92個。合并4個藥物數(shù)據(jù)，并去除重復(fù)的成分及靶點，得到四逆散123種化學(xué)成分，245個靶蛋白。通過DisGeNET平臺獲得靶點基因167個，通過OMIM平臺獲得靶點基因34個，通過GeneCards平臺獲得靶點基因2 791個，relevance score≥30的基因有140個，將3個平臺匯總并去除重復(fù)項，最終獲得IBS相關(guān)基因302個。

2.2? 四逆散治療IBS的潛在關(guān)鍵作用靶點

使用Omicshare平臺將藥物的潛在作用靶點和疾病的相關(guān)靶點進行匹配并繪制韋恩圖，獲得交集基因47個。其中，柴胡的潛在關(guān)鍵作用靶點39個，白芍16個，枳實21個，甘草41個。見圖1、表1。

2.3? 四逆散治療IBS關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將四逆散治療IBS的47個關(guān)鍵靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中獲取PPI關(guān)系，并得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。該網(wǎng)絡(luò)圖共47個節(jié)點，466條邊。其中，度值排名前5的靶點基因為IL-6、AKT1、TP53、TNF、FOS。見圖2。

2.4? 藥物-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析

在構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖前，需將作用于靶點的藥物成分信息進行篩選提取，通過Perl腳本的運行構(gòu)建彼此相應(yīng)的關(guān)系，獲得四逆散治療IBS相關(guān)靶點對應(yīng)的有效成分信息。然后將四逆散、89個作用于靶點的藥物活性成分的分子編碼、47個關(guān)鍵靶點信息、IBS導(dǎo)入Cytoscape，進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化。其中，槲皮素、山柰酚、川陳皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、芒柄花素、甘油三酯、刺果甘草查耳酮、1-甲氧基菜豆素、3-甲氧基光甘草定、β-谷甾醇等43種成分可以和3個以上的關(guān)鍵靶點相連，連接度值排名前5的靶基因為AR、NOS2、PPARG、SCN5A、KCNH2，表明以上成分及基因是四逆散治療IBS的重要成分和重要靶點。見表2、圖3。

2.5? 關(guān)鍵靶點的GO分析和KEGG通路分析

GO分析結(jié)果顯示，關(guān)鍵靶點所富集的生物學(xué)過程以對化學(xué)信號的反應(yīng)（36個靶點）、對氮化合物反應(yīng)（19個靶點）、多細胞生物過程的調(diào)節(jié)（24個靶點）、對有機氮化合物的反應(yīng)（19個靶點）、對含氧化合物的反應(yīng)（27個靶點）為主。見圖4。

KEGG通路主要富集的通路為細胞因子-細胞因子受體相互作用通路、T細胞受體信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路、類NOD受體信號通路等，并與炎癥性腸病、非酒精性脂肪肝等消化系統(tǒng)疾病有關(guān)。見圖5。

2.6? 分子對接分析

皮素、芒柄花素4個成分和IL-6（PDB ID：1alu）、AKT1（PDB ID：3mv5）、TP53（PDB ID：6ggc）、TNF（PDB ID：2az5）4個靶蛋白進行分子對接。4種化合物與4個靶蛋白的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明活性成分化合物與篩選出來的靶點發(fā)生作用的可能性較大，驗證了預(yù)測結(jié)果的可靠性。其中，槲皮素與各靶點的結(jié)合分數(shù)較佳，將其結(jié)合方式用PYMOL進行展示。見表3、圖6。

3 討論

四逆散為《傷寒論·辨少陰病脈證并治》名方，方中柴胡為君，疏肝解郁，升發(fā)陽氣;白芍為臣，斂陰養(yǎng)血柔肝，助柴胡條達肝氣;枳實為佐，理氣解郁，泄熱破結(jié)，與柴胡一升一降，調(diào)暢氣機，與白芍相配，理氣和血;甘草為使，調(diào)和諸藥，健脾和中;四藥合用，共奏疏肝健脾止瀉之功。

通過藥物-化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，柴胡、甘草中所含的槲皮素，柴胡、白芍、甘草的共同成分山柰酚，枳實中的川陳皮素，甘草中的芒柄花素在網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位。文獻[9]顯示，槲皮素不僅可以激活Nrf2信號通路，加強機體的抗氧化應(yīng)激水平相關(guān)，還可抑制NF-κB信號通路，降低促炎因子釋放，此外，槲皮素還能通過抑制腸道蠕動，降低腸道毛細血管的通透性來發(fā)揮止瀉作用。劉麗娜等[10]通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素可改善上皮細胞的通透性進而增強腸上皮屏障功能。研究[11]表明，山奈酚可顯著抑制炎癥因子的產(chǎn)生，提示其具有抗炎的作用。此外，山奈酚的抗炎機制還體現(xiàn)在調(diào)節(jié)促炎酶的活性和炎癥相關(guān)基因表達，抑制轉(zhuǎn)錄因子、黏附分子以及基質(zhì)金屬蛋白酶等方面[12]。川陳皮素具有雙向調(diào)節(jié)大鼠空腸平滑肌收縮性的作用，可顯著降低結(jié)腸通透性，保護受損的腸黏膜屏障[13]。芒柄花素通過抑制外鈣內(nèi)流及內(nèi)鈣釋放等離子通道相關(guān)機制，對家兔離體小腸的平滑肌收縮起到了明顯的抑制作用，說明其可應(yīng)用于治療腸痙攣性疾病及腸道動力紊亂等疾病[14]。上述4種物質(zhì)均屬于黃酮類化合物，預(yù)測結(jié)果與報道基本一致，體現(xiàn)了四逆散治療IBS多成分多靶點協(xié)同作用的方式。

PPI網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果顯示，IL-6、AKT1、TP53、TNF 4個靶點在網(wǎng)絡(luò)中占有重要地位，同時，經(jīng)過分子對接結(jié)果驗證，提示它們可作為四逆散治療IBS的關(guān)鍵靶點。IL-6是人體內(nèi)重要的炎性因子，作為炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)介質(zhì)，它促使疾病進展并維持免疫反應(yīng)[15]。研究[16-17]發(fā)現(xiàn)，低度的炎癥或免疫激活，可以觸發(fā)或加重IBS，而IL-6可通過作用于腸道神經(jīng)元和平滑肌細胞的方式引起感覺運動功能的改變，造成腸黏膜敏感性升高，這也解釋了IBS患者外周血中IL-6含量明顯升高的原因。TNF與IL-6同為促炎細胞因子，具有多種生物學(xué)活性，比如影響NF-κB通路，通過正反饋的方式使得炎癥反應(yīng)逐級放大[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)，IBS患者血清中的TNF-α水平明顯高于正常人，且有焦慮或抑郁等伴隨癥狀的患者TNF-α水平高于單純的IBS患者。感染性胃腸炎的患者更容易發(fā)生IBS，這可能與感染后導(dǎo)致的炎癥細胞趨化和免疫細胞的激活有關(guān)，該過程會釋放多種炎性介質(zhì)如TNF、IL等，進而破壞腸黏膜屏障，增加其通透性，誘導(dǎo)IBS的發(fā)生[20]。上述細胞因子在IBS發(fā)病過程中起到重要作用，四逆散的藥效成分可能通過作用于這些疾病的靶蛋白來調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)進而發(fā)揮治療IBS的作用。

KEGG通路富集分析得到與免疫和炎癥相關(guān)的一類通路，以T細胞受體信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、NF-κB信號通路為代表。Toll樣受體信號通路作為經(jīng)典的炎癥通路，在機體應(yīng)激條件下，該通路中受體異常激活，使下游κB等信號分子激活，導(dǎo)致炎性細胞和炎性因子失衡，進而造成IBS的發(fā)生和發(fā)展[21]。此外，Toll樣受體、NF-κB信號通路的激活可導(dǎo)致慢性內(nèi)臟痛覺高敏的形成[22]。這些通路均與IBS的發(fā)展有密切關(guān)系，且富集結(jié)果提示，四逆散的藥效成分的關(guān)鍵靶點分布于不同的通路，T細胞受體信號通路可能通過調(diào)控TNF、AKT1等靶點，TNF信號通路、Toll樣受體信號通路可能通過調(diào)控TNF、IL-6、AKT1等靶點起到四逆散治療IBS的效果，以上通路及靶點主要通過減輕免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的方式發(fā)揮治療IBS的作用。這些通路及蛋白靶點可作為未來進一步探討和研究的方向。

本文應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，從系統(tǒng)生物學(xué)的角度對四逆散治療IBS多成分、多靶點、多通路的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系和機制進行探討。通過網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、通路富集，從分子網(wǎng)絡(luò)水平系統(tǒng)研究了四逆散的主要活性成分及其關(guān)鍵作用靶點和相關(guān)通路，為深入研究四逆散治療IBS的作用機制提供了思路。

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（本文編輯? 賀慧娥 黎志清）