程序性死亡通路在膽紅素腦病機(jī)制中的研究

陽華妹

（桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院新生兒科，廣西 桂林 541199）

細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）是機(jī)體為維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由多種基因調(diào)控的細(xì)胞自主有序的死亡，目前共發(fā)現(xiàn)有5種死亡類型，具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制未完全闡明。目前對非結(jié)合白蛋白的膽紅素（unconjugated bilirubin with albumin，UCBA）介導(dǎo)腦損傷的研究涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡、細(xì)胞自噬。膽紅素腦損傷的分子機(jī)制，新生兒血液中高濃度的UCBA可進(jìn)入血腦屏障，主要作用于中樞神經(jīng)核團(tuán)的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等[1，2]，通過細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜，介導(dǎo)中樞神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)、興奮性氨基酸、線粒體的能量衰竭、鈣信號傳導(dǎo)異常、細(xì)胞周期改變、半胱天冬酶激活等下游事件，引起中樞神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腦損傷[3，4]。本文重點(diǎn)就其中信號通路的標(biāo)志物的研究進(jìn)行綜述，為深入研究膽紅素腦病的發(fā)病機(jī)制提供新的視角，利于進(jìn)一步研究膽紅素腦病的干預(yù)靶標(biāo)。

1 細(xì)胞凋亡

1.1 細(xì)胞凋亡的特點(diǎn) 1972年Kerr發(fā)現(xiàn)鈣信號異常誘發(fā)大鼠前列腺退化中的凋亡細(xì)胞缺失而提出，細(xì)胞凋亡參與多系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制，形態(tài)表現(xiàn)為死亡的細(xì)胞膜損壞，萎縮，胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)固縮，DNA降解，有凋亡小體，特點(diǎn)是無炎癥反應(yīng)[5]。凋亡依賴Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白系統(tǒng)與促凋亡系統(tǒng)的調(diào)控，活化的半胱天冬酶Caspase-3、Caspase-12為最終效應(yīng)蛋白，共有3種信號通路途徑，目前研究最成熟，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍未完全闡明。

1.2 細(xì)胞凋亡的信號通路

1.2.1 線粒體途徑（Ca2+-Caspase-9-Caspase-3通路）直接的觸發(fā)機(jī)制[4，6]：線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（mitochondrion Adrian permeability transit ion pore，MPTP）過度開放[4]，線粒體膜上的Bcl-2家族中的Bad（非磷酸化的）聯(lián)結(jié)Bax的同型二聚體，使Bax發(fā)生構(gòu)象變化，形成單聚化并轉(zhuǎn)移至線粒體外膜，引起MPTP的開啟。信號通路：①Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt C）釋放，MPTP反應(yīng)開放使線粒體的Ca2+內(nèi)流，Cyt C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)和活化，導(dǎo)致跨膜電位降低、ATP合成減少及下游的半胱天冬酶前體（procaspase）活化。②凋亡小體形成：Cyt C釋放后與Apaf-1形成Apaf-1/Cyt C復(fù)合體，復(fù)合體使Apaf-1發(fā)生構(gòu)象變化，促進(jìn)復(fù)合體與ATP/dATP的結(jié)合，激發(fā)其多聚化，從而形成凋亡體（apoptosis body）。細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)：凋亡體募集胞漿中的procaspase-9，通過自剪切激活后啟動(dòng)Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，繼續(xù)活化下游Caspase-3、7等，并形成正反饋。細(xì)胞凋亡的執(zhí)行：活化的Caspase-3能對其底物進(jìn)行特異性切割，使DNA形成碎片，致使細(xì)胞凋亡。調(diào)控：Bcl-2家族：抗細(xì)胞凋亡的蛋白：Bcl-2、Bcl-x（L）等，如活性下調(diào)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1，BH2，BH3，BH4）：該酶無活性，但可增加線粒體膜的通透性。促細(xì)胞凋亡的蛋白：Bax，Bak，以及Bid，Bim，Bad等（只含有BH3結(jié)構(gòu)域）等。國內(nèi)外己有大量膽紅素腦病的哺乳動(dòng)物模型中檢測到線粒體途徑的信號分子，證實(shí)了非白蛋白結(jié)合的膽紅素誘導(dǎo)Bax表達(dá)[6，7]，控制線粒體膜的通透性和跨膜電位，破壞細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)致Ca2+信號異常[3，8]，促使Cyt C釋放、活化的Caspase-9、Caspase-3表達(dá)及細(xì)胞形態(tài)改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。并且凋亡抑制劑能減輕膽紅素誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[7]。

1.2.2 死亡受體活化途徑（Ca2+信號—Caspase-8-Caspase-3活化途徑）細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，激活并連接鈣調(diào)磷酸酶，使腫瘤壞死因子超家族轉(zhuǎn)錄因子去磷酸化，啟動(dòng)受體活化途徑[10]。目前發(fā)現(xiàn)的死亡受體途徑主要有3種，其中UCBA介導(dǎo)的中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡的死亡受體活化途徑目前僅有2種報(bào)道。其共同特點(diǎn)為死亡受體與特定的配體相結(jié)合，發(fā)生三聚化和構(gòu)象變化，通過死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）與其它連接蛋白組成復(fù)合物，死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)的Fas蛋白（fas protein associated with the death domain，F(xiàn)ADD）和TNFR蛋白TNFR-associated protein with death domain，TRADD），或死亡效應(yīng)區(qū)（death effector domain，DED）等結(jié)合組成復(fù)合物，激活procaspase-8，之后分別通過兩種途徑最終激活procaspase-3，活化的Caspase-3引起細(xì)胞凋亡。①Fas/Fasl途徑：自殺相關(guān)因子（factor associated suicide，F(xiàn)as）與其配體（factor associated suicide brigands，F(xiàn)asl）是經(jīng)典的途徑[10]，細(xì)胞表面的Fas受體與Fasl的三聚體結(jié)合，募集DD、FADD的DED，集合procaspase-8的DED，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體（death-induced signaling complex，DISC），從而激活procaspase.8，使其水解、切割成活化的caspase-8，再激活下游不同的Caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活caspase-3，經(jīng)外源性途徑誘導(dǎo)凋亡；或Caspase-8切割位于胞漿的Bid，截?cái)喑葿id（bid），bid通過3-OH端與線粒體連接，誘導(dǎo)Cyt C釋放，激活前述內(nèi)源性（線粒體）途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，暴露于高濃度UCBA的鼠腦組織或神經(jīng)元中的細(xì)胞凋亡信號分子Fas/Fasl和Caspase-3、Caspase-8的過度表達(dá)，以及Bid被切成截短的Bid（bid）[9，11]，表明UCBA介導(dǎo)了中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡的Fas/Fasl途徑，引起細(xì)胞凋亡。但對于UCBA介導(dǎo)這一信號通路途徑中的完整的基因檢測的研究罕見報(bào)道。②TNFR途徑：TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）與TNF結(jié)合成三聚體，集合TRADD、FADD、TRAF-2和RIP1，F(xiàn)ADD依次激活caspases.8、caspase.3促凋亡[12]。復(fù)合物I形成及泛素化使NF-KB，抑制凋亡，TNF聯(lián)結(jié)DD與TNFR1后發(fā)生三聚化，集合TRADD和其它蛋白，如TNF-α 相關(guān)因子2（TNF receptor associated factors，TRAF2）、細(xì)胞凋亡抑制蛋白（cell ular inhitor of apoptosis protein，cIAP）cIAP1、cIAP2、受體相互作用蛋白1（receptor interacting proteins，RIP1），形成復(fù)合物I結(jié)合到質(zhì)膜上。復(fù)合物I激活NF-κB和AP-1。非降解性多聚泛素鏈修飾RIP1等銜接蛋白，形成泛素化狀態(tài)。泛素化激活I(lǐng)kB激酶（kappaKinsey，IKK），將NF-κB抑制蛋白IkBa磷酸化后，IkBα 被泛素蛋白酶復(fù)合體降解，使NF-kB激活后移位到細(xì)胞核并轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制蛋白（inhibitor of apotheosis protein，IAP）如 cIAP -l、cIAP -2、cFLIP、TRAFl、TRAF2等的轉(zhuǎn)錄[6]。去泛素化和DISC形成，激活Procaspase-8，發(fā)生細(xì)胞凋亡，去泛素化酶降解多聚泛素鏈修飾RIP1的反應(yīng)，使其去泛素化，聚合RIP3以及TRADD、FADD、Procaspase-8組成復(fù)合物11（即DISC），Procaspase-8活化，使RIP1、RIP3剪切失活，進(jìn)而激發(fā)前述2種內(nèi)源性和外源性途徑[4]，最終形成caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。DISC形成后，如NF-kB如被激活，cFLIP轉(zhuǎn)位到DISC，阻止Procaspase-8的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡，反之促凋亡。抑制Caspase可阻止RIP1泛素化，刺激DISC復(fù)合物的形成[12，13]，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。國外研究發(fā)現(xiàn)[9，14]，大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞體外暴露于UCBA中會(huì)增加TNFR途徑中的TNFR1和NF-KB、IL-1β、Caspase-8、Caspase-3的表達(dá)；而使用FNFR1基因沉默技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)降低膽紅素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)論支持了TNFR信號通路在膽紅素腦損傷機(jī)制中的重要作用[9，13]，但具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制未進(jìn)行深入研究。

1.2.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERS）ERS是近年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡信號通路。ER是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及折疊、聚集的場所。內(nèi)環(huán)境紊亂或損傷因素可引起非折疊的蛋白或錯(cuò)誤折疊的蛋白在細(xì)胞內(nèi)過多地聚集，啟動(dòng)一系列基因表達(dá)，引起ERS，以促進(jìn)損傷的修復(fù)，嚴(yán)重ERS則促進(jìn)損傷效應(yīng)，引起細(xì)胞凋亡。目前對其信號通路的研究主要是非折疊蛋白的反應(yīng)（unfolded protein reaction，UPR），并與線粒體途徑和死亡受體活化途徑相互作用[18]。UPR-Caspase-12活化途徑[14，15]3個(gè)代表非折疊蛋白的反應(yīng)的標(biāo)志性分子（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1、aATF6、PERK）與免疫球蛋白結(jié)合蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulating protein78，GRP78）/Bi的解離，促進(jìn)中間信號分子c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinsey，JNK）、CHOP、Bcl-2家族的活化，最終啟動(dòng)Caspase-12活化，具體信號通路如下：CHOP：從GRP78/Bi解離的R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶蛋白激酶（protein Kinsey R-like ER Kinsey，PERK）被磷酸化，并依次激活真核起始因子2（eurydice imitation factor-2，eIF2）、eIF2、ATF4；肌醇需求酶1-a（luminosity-requiring enzyme 1，IRE1-a）；依次激活TRAF2、ASK1、P38蛋白激酶（P38MAP）；激活轉(zhuǎn)錄激活因子6（activating transcription factor 6，ATF6），經(jīng)高爾基體作用生成P50 ATF6。此3條途徑均能激活CHOP，激活的CHOP過多聚集在細(xì)胞核內(nèi)，直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡，下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不明。另外CHOP、JNK還可通過上調(diào)Bcl-2家族BH3-only蛋白，以及促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+向細(xì)胞質(zhì)釋放，進(jìn)入線粒體/死亡受體凋亡信號途徑。JNK：JNK通過2種方式依次激活I(lǐng)RE1-a、TRAF2、ASK1，或通過激活Fas從而激活JNK，促進(jìn)細(xì)胞凋亡：JNK通過磷酸化Bcl-2、Bcl-xL，抑制其抗凋亡作用；或使Bid、Bim磷酸化，加強(qiáng)其促凋亡作用。Caspase-12 ERS時(shí)，IREla激活募集的TRAF2，切割活化的Caspase-12，并依次使procaspase-9、procaspase 3被活化，使DNA被剪切，發(fā)生細(xì)胞凋亡。UCBA與中樞神經(jīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究，近年來，國內(nèi)外較多哺乳動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，UCBA誘導(dǎo)中樞神經(jīng)的信號 分 子CHOP RNA、GRP78、PERK、IRE1-a、eIF2、ATF6、IRE1-a、c-Jun、Caspase.12、JNK等的過表達(dá)，其基因變化符合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊的蛋白反應(yīng)的全組基因組地表達(dá)[16]，證實(shí)在膽紅素腦損傷的機(jī)制中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有重要作用，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抑制劑可能是降低膽紅素UCBA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的潛在治療方法[17]。

2 細(xì)胞自噬

特點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)被自噬泡（雙層膜結(jié)構(gòu)）包裹，并與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，之后細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)被降解利用。內(nèi)環(huán)境紊亂等因素促進(jìn)自噬地激活，抑制細(xì)胞凋亡，如失控則引起自噬性死亡。

2.1 信號通路啟動(dòng) MTOR-BULK-III級P13K等復(fù)合體通路，饑餓、缺氧、ERS、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapacity，MTOR）抑制劑下，AMPK活化，MTOR失活[2，18]。活化的AMPK催化復(fù)合體ULK（成分：mAtg13、FIP200、ULK1、ULK2）的多位絲氨酸（317、467、555、574、637、777）發(fā)生磷酸化[19]，促進(jìn)自噬。如AMPK失活，第757位絲氨酸與MTOR結(jié)合使其活化，則抑制自噬。

2.2 復(fù)合物和自噬體 Beclin-1（酵母Atg6同源物）結(jié)合P150（酵母Vps15同源物）和hVps34、Bark或抗紫外線照射的基因（UVRAG）共同組成III級P13K復(fù)合體[19]，是與自體吞噬相關(guān)的基因。自噬體的生成需Atg12-Atg5結(jié)合微管相關(guān)蛋白II輕鏈3（microtubule -associated protein light chain 3 -II，LC3-II）形成復(fù)合物：Atg12-Atg5形成需Atg7和Atgl0泛素樣反應(yīng)，繼而Atgl2-Atgl25連接。LC3的C端被Atg4蛋白所酶切之后生成LC3-I（需磷脂酰乙醇胺和LC3-I連接Atg3和Atg7），自噬體膜吸附連接后的LC3-I和LC3-II。然后，Atg12-Atg125與Atg6組成更大的復(fù)合物。

2.3 上游UPR調(diào)控通路 研究發(fā)現(xiàn)[2，18]，細(xì)胞自噬是ERS的下游通路。ERS通過PERK、IRE1、ATF6途徑誘導(dǎo)自噬，PERK激活磷酸化的eIF2，活化Atg12觸發(fā)自噬；IRE1通過與胞漿銜接TRAF2激活JNK，上調(diào)Atg5、Atg7，均導(dǎo)致LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化增加，LC3-II增多促進(jìn)自噬。胞腔內(nèi)Ca2+通過活化依賴鈣調(diào)蛋白的蛋白激酶（the protein kinase that dependent calmodulin），激活A(yù)MPK，使MTOR的活性降低，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[19]或Ca2+通過抑制自噬體的降解促進(jìn)細(xì)胞自噬[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)局部產(chǎn)生的R0S可激活JNK，也促進(jìn)細(xì)胞自噬。但細(xì)胞缺氧時(shí)，ATF4直接與AMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic-AMP response element binding protein，CREB）結(jié)合，使LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化，促進(jìn)ERS以及依托ATF4的細(xì)胞自噬。國外部分研究發(fā)現(xiàn)[2，18]，鼠的膽紅素腦病模型中LC3-I向LC3-II轉(zhuǎn)化，UCBA誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y自噬的模式為鈣/PKC信號傳導(dǎo)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、MTOR失活。以上研究證實(shí)了細(xì)胞自噬在膽紅素腦病中的作用。自噬是未連接白蛋白的膽紅素誘導(dǎo)ERS的下游通路及晚期事件，有研究發(fā)現(xiàn)人和鼠模型中自噬促生存，也有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)膽紅素早期誘導(dǎo)細(xì)胞自噬促進(jìn)存活，后期促進(jìn)死亡。

3 細(xì)胞焦亡

3.1 細(xì)胞焦亡的特點(diǎn) 細(xì)胞焦亡是近年新發(fā)現(xiàn)的一種高度炎癥性的細(xì)胞程序性死亡；在形態(tài)上與凋亡相似，但同時(shí)伴隨炎性介質(zhì)釋放，這一特性又與壞死相似[22]。

3.2 信號通路 主要包括經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑。經(jīng)典途徑：Caspase.1作為關(guān)鍵酶被激活后促進(jìn)底物的剪切和多聚化，底物包括多種Mastermind（GSDM）家族成員。其中GSDMD被Caspase-1剪切后，通過N端成孔結(jié)構(gòu)域（PFD）多聚化，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)孔隙[23]，引起細(xì)胞焦亡；此外，Caspase 1還能切割炎癥因子的前體，使pro-IL 1β 和pro-IL 18活化成IL 1β 和IL 18，引起炎癥反應(yīng)，同時(shí)通過多種炎性通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，加重細(xì)胞焦亡的損傷級聯(lián)[22，24]。非經(jīng)典的信號通路由激活Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11來實(shí)現(xiàn)。抑制細(xì)胞孔隙的形成是阻斷細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵[23]。

3.3 UCBA介導(dǎo)的中樞神經(jīng)細(xì)胞焦亡地研究 重慶大學(xué)華子瑜團(tuán)隊(duì)的研究證實(shí)了未連接白蛋白的膽紅素誘導(dǎo)鼠大腦皮質(zhì)星型膠質(zhì)細(xì)胞和海馬組織中細(xì)胞焦亡關(guān)鍵酶Caspase-1的活化，以及腦組織中細(xì)胞焦亡相關(guān)炎癥因子IL 1β、IL 18和炎性小體NLRP3的表達(dá)增高，DNA斷裂細(xì)胞增多，并發(fā)現(xiàn)Caspase-1抑制劑阻斷細(xì)胞焦亡的作用[24]，初步證實(shí)細(xì)胞焦亡參與了膽紅素介導(dǎo)的腦損傷的發(fā)病機(jī)制，目前尚未發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步深入的研究。

4 總結(jié)

UCBA誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞程序性死亡的信號通路中，各信號通路在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和/細(xì)胞膜水平通過鈣信號、Bcl-2/Bax系統(tǒng)、JNK和炎癥因子關(guān)聯(lián)和調(diào)控，而Caspase-3是多種級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵的蛋白酶和最終效應(yīng)蛋白，機(jī)制復(fù)雜，且3種程序性細(xì)胞死亡均為一般情況下的促生存，和失控情況下的促死亡，故研究某種干預(yù)作用時(shí)需觀察對各種細(xì)胞程序性死亡方式的影響。并需動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)、血清標(biāo)志物，結(jié)合臨床表現(xiàn)多種方式來研究，切忌片面化，未來需進(jìn)一步深入探討。