Geno-type MTBDRplus分子線性探針雜交技術在結核病診斷與耐藥性檢測中的應用價值

李 津,李昌錦,楊 潔,黃 婷,樊金燕

（聯勤保障部隊第900 醫院a.結核科;b 檢驗科,福州350003）

結核菌耐藥是結核病治療過程中面臨的主要問題，其療程長、藥物副反應多且嚴重、患者預后差，已受到越來越多的關注。據統計我國每年新發結核病例中，5.7%為多重耐藥結核患者，其中又有8%為泛耐藥結核分枝桿菌感染[1]。因而結核菌耐藥性檢測極為重要。目前臨床上多采用BD 960 液體培養法進行結核分枝桿菌的鑒定及耐藥性的檢測，該方法敏感度低、耗時較長，往往導致診斷及針對性治療的延誤。隨著結核菌耐藥機制的不斷進展，Geno-type MTBDRplus 分子線性探針雜交技術逐步得到重視。這種方法應用生物素標記的引物進行靶序列的擴增，并與固定的寡核苷酸探針雜交，最后通過酶聯免疫法顯示結果[2]。該技術不僅可對結核分枝桿菌復合群保守序列進行鑒定，還可根據相關基因突變對異煙肼和利福平的耐藥表型進行檢測。本研究應用線性探針法對結核菌樣本進行檢測，并與BD 960 液體培養法的檢測結果及其藥敏結果進行比較，對兩種方法的檢測效果進行評價，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2016年1月～2019年12月在本院門診及住院的臨床確診結核病患者的送檢標本413 例，其中男性315 例（76.27%），女性98 例（23.73%）。年齡8～89 歲。

1.2 儀器與試劑 BACTEC MGIT 960 及相關試劑（美國BD 公司）；GT-Blot 48 及相關試劑（德國Hain Lifescience 公司） ；結核分枝桿菌抗原試劑盒（杭州創新生物公司）；抗酸染色液（珠海貝索公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 BD 960 液體培養法檢測結核分枝桿菌及異煙肼、利福平耐藥性 :嚴格按儀器使用說明書操作，培養陽性標本經抗酸染色鏡檢并用結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒鑒定為結核分枝桿菌。

1.3.2 線性探針雜交法檢測結核分枝桿菌及異煙肼、利福平耐藥性:嚴格按儀器使用說明書操作，將PCR 擴增、反向雜交、膜顯色技術合為一體，通過引物擴增目的片段，擴增產物與膜上固定的特異性探針雜交，雜交物通過酶顯色反應判斷結果。

1.4 統計學分析 應用SPSS 17.0 軟件進行統計分析，兩種檢驗方式一致性分析采用Kappa 值檢驗。Kappa 值0.0～0.20 代表極低的一致性，0.21～0.40 代表一般的一致性，0.41～0.60 代表中等的一致性，0.61～0.80 代表高度的一致性，0.81～1 代表幾乎完全一致。

2 結果

2.1 兩種方法對結核分枝桿菌檢出率的比較 413例臨床確診病例的樣本，經BD960 液體培養法檢測呈陽性為376 例（91.04%），經抗酸染色鏡檢及凱必利鑒定均為結核分枝桿菌。上述樣本經雜交酶顯色法檢測呈陽性為358 例（86.68%）。兩種檢測方法的結果相符349 例，符合率為84.5%（349/413），檢測結果高度一致。

2.2 兩種方法對異煙肼、利福平藥敏檢測結果的比較 用BD960 液體培養法和雜交酶顯色法對108株結核分枝桿菌進行異煙肼、利福平藥敏檢測。兩種檢測方法均測定異煙肼敏感有83 例，符合率為76.85%（83/108），Kappa 值=0.731，兩者具有高度一致性 ；兩種檢測方法均測定利福平敏感者有94例，符合率為87.04%（94/108），Kappa 值=0.793，兩者結果亦高度一致。

3 討論

據2020年10月14日，世界衛生組織（WHO）發布了《2020年全球結核病報告》中估算，全球結核病潛伏感染人群接近20 億，2019年全球新發結核病患者約996 萬，發病率為130/10 萬，新發的結核病患者中約有3.3%的新患者和18%的復治患者對利福平耐藥。估算利福平耐藥結核病患者約46.5萬，其中耐多藥結核病約占78%。因此，結核菌耐藥株是我國結核病防治所面臨的主要挑戰，其治療療程長、藥物副反應多且難以耐受、患者預后差，尋找一種快速檢測且同時檢測利福平耐藥的技術已受到越來越多的關注。近年來，線性探針法已被WHO推薦用于結核分枝桿菌耐藥株的快速檢測[3]。

本研究顯示，BD960 液體培養法和雜交酶顯色法檢測結核分枝桿菌的結果高度一致。由于本研究是回顧性觀察分析，部分患者未做藥敏及耐藥檢測，所以藥敏檢測菌株例數較少。在藥敏檢測結果上與之前相關報道略有不同[4-5]，其原因有待于今后進一步分析。但有研究認為，在細菌量級別為“極低”時，存在無法確定是否對利福平耐藥及對利福平耐藥檢測結果的假陽性例數明顯偏高[6]。

由于異煙肼和利福平是治療結核病的一線藥物，其產生耐藥是治療失敗的主要原因之一，而傳統藥敏實驗采用羅氏固體培養基或BD 960 液體培養法檢測結核分枝桿菌的耐藥耗時長（42 天），嚴重影響臨床對患者的及時診治。與之相比，雜交酶顯色法具有操作快速、且直接檢測臨床標本的優點，不必等待結核菌的培養結果，從而顯著縮短了檢測周期。另外，雜交酶顯色法與GeneXpert 等快速分子診斷技術不同，它不僅檢測利福平的耐藥情況，而且同時進行異煙肼的耐藥性檢測，對于臨床快速診斷、并檢測藥物的耐藥情況，進行準確評估、制定、實施有針對性的個體治療提供重要診斷依據。近來研究表明，PCR 線性雜交酶顯色法與傳統培養法具有較高的一致性，并可明顯縮短肺外結核的病原菌耐藥性分析的等待時間[7-8]。另外，有研究者指出，初治患者使用分子生物學快速檢測技術做出利福平耐藥或耐多藥結核病的診斷特別注意要進行二次確認，以減少錯誤的診斷和治療[9]。本研究因經費原因，所有菌株并未進行測序及耐藥突變基因的檢測進行確認。

研究表明，PCR 線性雜交酶顯色法是一種經濟、快捷的結核病實驗診斷技術[10]，它與其他檢驗方法聯合應用可進一步提高結核病的診斷效率[11-12]。輔以其他促進排痰的方法，檢測陽性率將進一步提高[13]。本研究發現，PCR 線性雜交酶顯色法是一種快速、可靠的檢測方法，能在24 h 內判斷出是否存在結核分枝桿菌感染。因此，我們推測，在經過BD 960 液體培養法培養后，可以不需要42 天的培養，在培養周期中優化選擇出一個比較好的時間節點培養出數量級別的桿菌后，再使用PCR 線性雜交酶顯色法，可以清楚直觀地顯示INH 和RIF 的耐藥情況，增加結果的準確性。