液體活檢技術在上尿路上皮癌精準診治中的最新應用研究進展

胥 勁，何 訸，黃亨建

（四川大學華西醫院實驗醫學科，成都 610041）

腫瘤的發生通常由于調控細胞生長和增殖的基因不斷變化積累導致[1]。目前實體腫瘤的基因圖譜是通過組織樣本構建的。然而基于組織活檢技術的結果會受到抽樣誤差和樣本采集難度的影響，只能反映腫瘤異質性的特征，檢測結果往往不能重復[2-3]。人類體液樣本中的物質包括循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）、循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）及RNA，細胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）、蛋白質和代謝產物等。由于腫瘤細胞的快速代謝會導致腫瘤衍生的細胞、核酸和囊泡不斷釋放到血液循環中，因此檢測血液及其他體液中腫瘤來源的成分，能幫助臨床醫生重復性并且非侵入性地觀察癌癥患者疾病的動態演變過程，從而方便快捷地達到個體化診斷和治療的目的，這項技術稱之為液體活檢技術（liquid biopsy，LB）[4]。

上尿路上皮癌（upper tract urothelial carcinoma，UTUC）是一種惡性程度較高的腫瘤，發生于泌尿道尿路上皮，涉及腎盂到輸尿管末端整段，是一類由遺傳因素和環境因素共同致病的復雜疾病[5]。UTUC 占所有腎臟腫瘤的5%～7%，年發病率約為1/10 萬～2/10 萬，發病率呈逐年上升趨勢[5-6]。與歐美國家相比，我國UTUC 發病率更高，約占所有尿道上皮腫瘤的20%～30%，且分級更高、分期更晚[7-8]。傳統UTUC 診斷主要依靠影像學、輸尿管鏡和尿脫落細胞學檢查，其敏感度和特異度有限，容易漏診。大多數UTUC 患者診斷時已為中晚期，生存率低、生活質量差，社會負擔重[9]。因此，尋找敏感度高、特異度強的無創或微創便捷的方式，建立快速、簡便的早期診斷技術已成為UTUC 診治的研究重點。

基于此，本文對液體活檢技術在上尿路上皮癌精準診治中的最新應用研究進展進行了綜述。提示我們，若能通過無創或微創的方式對UTUC 高危人群進行有效早期診斷，建立高效精準的早期診斷預警體系，對改進UTUC 診斷體系，實現早期診斷具有重大的意義，同時還能使治療窗口前移，極大地提高患者生存率及生存質量。

1 UTUC 的標志物和檢測技術

UTUC 的具體發病機制目前尚不明確，外部環境因素和內在遺傳因素都可以影響其發生、發展和預后。遺傳性UTUC 占總體的10%～20%[6]，但導致UTUC 發生的相關遺傳因素目前尚不清楚。因此，從遺傳學角度尋找敏感度高、特異度強的分子標志物，建立快速、簡便、無創的精準診斷技術可為UTUC 的診治提供新的思路。近年來，隨著腫瘤生物學研究的深入、分子生物技術的發展及測序成本的大幅度降低，該方向的研究取得了一定進展，相關研究成果也不斷增加。

1.1 循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）CTCs 是原發腫瘤在形成和生長過程中釋放進入外周血或淋巴組織，以單個游離形式或聚集成團形式存在于血液淋巴循環系統，具有一定的靶向轉移潛能[10]。目前CTCs 主要用于腫瘤疾病療效監測、預后判斷和復發風險評估。SOAVE 等[11]對膀胱尿路上皮癌的CTCs 研究發現，在實施根治性手術前，CTCs 可以在不同組織類型中檢測到，檢出率具有差異性，并且其前瞻性研究同時證實CTCs 還是不良預后的獨立預測因子。ZHANG 等[12]的meta 分析認為外周血中存在的CTCs 不僅可以用于疾病確診，還是尿路上皮癌患者不良預后的獨立預測指標。CTCs 作為一種非侵入性的檢測方法在UTUC 預后判斷中發揮的作用具有潛在研究價值。

由于CTCs 在外周血中的含量存在較大差異，目前CTCs 檢測方法的特異度和敏感度較低，其臨床應用仍面臨嚴峻的挑戰[13]。STOTT 等[14]對115例轉移性肺癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌和結腸癌患者外周血中的CTCs 研究發現，每毫升血液中CTCs 的濃度為5～1 281 個。但總體而言大多數癌癥患者早期外周血中CTCs 每毫升血中含量僅為1～200 個[15]，因此很難在疾病早期對CTCs 進行定性和定量分析。目前關于CTCs 檢測技術的研究主要集中在樣本富集、富集后的分離純化及CTCs 離體培養方法[16]。單細胞測序技術的發展使得對單個細胞轉錄組、基因組、甲基化組和蛋白質組進行分析成為可能[17-18]，讓CTCs 在腫瘤的診斷、治療選擇、藥物篩查和疾病監測方面的潛力得到進一步釋放。盡管單細胞測序技術得到不斷改進，但仍然存在隨機性強、覆蓋率低、錯誤率高和細胞間異質性等缺點[19]。

1.2 循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）ctDNA 主要是死亡的腫瘤細胞破裂后所釋放出來的片段化的基因組DNA。ctDNA 中能夠檢測到的遺傳變異信息非常豐富，從簡單的點突變到復雜的結構變異，甚至到染色體拷貝數變異都能被檢測到。但是ctDNA 的檢出率高度依賴于腫瘤發展階段、腫瘤類型及檢測手段，ctDNA 在腫瘤早期或局限性腫瘤中含量較低[20]。目前ctDNA 可以作為癌癥早期診斷、微小殘留病灶監測、化療效果評估、克隆性突變檢測及潛在的耐藥性評估的標志物[21]。目前公布的ctDNA 檢測數據主要集中在發病率較高的癌種，例如肺癌、結直腸癌、乳腺癌等，而針對發病率偏低的癌癥類型其研究相對較少[22]。在一項針對ctDNA 的基因組圖譜的研究中，對75 例轉移性UTUC 的血液樣本通過二代測序評估其cfDNA水平，在71 例患者（95%）中發現了遺傳改變，包括單核苷酸變異、插入、融合和拷貝數擴增，其中抑癌基因TP53（51%）、PIK3CA（23%）和 ARID1A（20%）是最常見的3 種基因改變。ctDNA 在不同腫瘤及不同樣本中表達存在差異，和膀胱癌患者相比，FGFR 和HRAS 變異在UTUC中更常見。而在轉移性UTUC 患者中，ctDNA 的TP53 和FGFR3 二代測序結果和以往腫瘤組織相比，ctDNA 中TP53 和FGFR3 的基因改變分別顯著減少和增加[25]。由于ctDNA 含量占血液中循環游離DNA（circulating cell-free DNA，cfRNA）的0.1～10%[23]，因此在大量cfDNA 中對ctDNA 進行特異度鑒定是一項艱巨的任務。和CTCs 相比，在腫瘤形成早期血液中還沒有出現CTCs 時已經存在ctDNA[24]。

目前檢測ctDNA 的方法主要分為基于PCR 的各種檢測技術和高通量測序[26]。通過對大于1 000例患者和850 例健康患者血液中循環蛋白和ctDNA突變來聯合檢測八種常見癌癥類型的研究中，聯合檢測具有69%～95%的敏感度（取決于癌癥類型）和 99%特異度[27]。高靈敏度的PCR 技術只能用于ctDNA 中特定的少位點突變，高通量測序雖然能解決PCR 的缺點，但同時容易受到非目標cfDNA 干擾[28]。

1.3 RNA 血清、尿液或組織中游離的mRNA 作為腫瘤的診斷或治療靶點具有實用、有效、基因突變可高通量篩選等優勢。LI 等[29]的研究發現，SPP1 mRNA 在UTUC 細胞和組織中高表達，SPP1 mRNA 表達水平增高與晚期、高級別密切相關。一項對622 例UTUC 患者的回顧性研究發現，mRNA結合蛋白族3（mRNA-binding protein Ⅲ，IMP3）表達與UTUC 復發、癌癥死亡率及全因死亡率獨立相關[30]。

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質的RNA，包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（longnon-coding RNA, lncRNA）和假基因、環形RNA（circular RNA,circRNA）等。ncRNA 作為液體活檢中的生物標記物對于泌尿腫瘤患者的診斷和隨訪具有重要的價值[31]。血清中全基因組miRNA 是一類具有高度保守性、時序性和組織特異度的小分子ncRNA。進展性和非進展性UTUC 患者之間存在不同的miRNA 表達模式，對UTUC 中特異度miRNA 進行分析，具有診斷和預測UTUC 患者預后的潛力[32-33]。TAO 等[34]對46 例UTUC 與30 例健康對照血清miRNA 進行分析，發現10 個具有區分UTUC 患者與健康對照潛力的miRNA，為miRNA 作為UTUC 診斷的潛在生物標志物提供證據。KE 等[35]研究發現miRNA-210 在UTUC 中高表達，與腫瘤進展相關。BRENDAN[36]對157 例UTUC 的回顧性研究發現，miRNA 有助于鑒定UTUC 分期并預測患者生存期和治療效果。雖然尚無文獻報道與UTUC 直接相關的circRNAs，但研究發現circRNA 可以miRNA的形式發揮功能，即circRNA 可以結合在miRNA上并對抗其抑制mRNA 的功能，這為circRNA 與UTUC 的關系提供研究思路[37-38]。

1.4 蛋白質及代謝產物 蛋白質及代謝產物可運用于腫瘤的診斷、治療和預后等多個方面。UTUC 患者術前纖維蛋白原水平升高是UTUC 高分期、高分級、遠處轉移的顯著相關因素，同時也是預后不良的獨立危險因素[39]；血清細胞角蛋白19 片段水平的升高是UTUC 術后生存率的獨立影響因子，其水平越高，術后總體生存率也較高[40]；尿液中的P16蛋白在UTUC 中高表達，Ki-67 常作為細胞增殖的標志物，P16 聯合Ki-67 的雙標記可作為預測高分級UTUC 或癌癥進展的獨立因素[41]。核基質蛋白-22（nuclear matrix protein-22，NMP-22）和膀胱腫瘤抗原（bladder tumor antigen，BTA）是膀胱癌尿液檢查中最常用的兩種生物學標志物。盡管UTUC 和膀胱癌基因改變相似，但NMP-22 卻不能用于上尿路移行細胞癌的診斷[27,42]。JOVANOVIC 等[43]對泌尿系統腫瘤患者尿液樣本研究發現，BTA 對上尿路腫瘤診斷的總體敏感度和特異度分別為82%和89%，而對UTUC 診斷的敏感度和特異度分別為48%和33%。

1.5 外泌體 外泌體是細胞內多囊泡與細胞膜融合后釋放到細胞外的約50～150nm 的膜性囊泡，可攜帶蛋白、脂質、DNA 和ncRNA 等多種內容物，參與免疫應答、抗原提呈和細胞間通訊等生理病理過程[44]。與循環系統中游離RNAs 相比，由外泌體所攜帶的RNAs 組織特異度及穩定性更高[45]。LEE 等[46]納入9 例接受尿路膀胱上皮癌的手術患者，發現尿液中的cfDNA 和外泌體DNA 可直接反應尿路上皮癌的體細胞突變和拷貝數變異。LIN 等[47]連續招募129 例泌尿系統腫瘤患者和62 例非泌尿系統腫瘤患者，運用MALDI-TOF 質譜法進行外泌體蛋白質組學分析，并采用免疫組化的方法在另外122 例泌尿系統腫瘤和26 例非泌尿系統腫瘤進行驗證，最終認為α1-抗胰蛋白酶和組蛋白H2B1K 可作為尿路上皮癌的診斷和預后生物標記物。

2 LB 在早期診斷、靶向治療、預后監測UTUC 中的運用前景

2.1 早期診斷 早期診斷UTUC 對提高患者生存時間和生活質量具有重要意義。早期UTUC 行根治性切除手術，患者5年生存率可達90%；而高分期UTUC 患者伴局部淋巴結轉移5年生存率通常不足30%，伴發遠處轉移5年生存率不足10%[48]。因此以液體活檢技術（Liquid biopsy，LB）作為診斷工具，對血液、精液、尿液及唾液在內多種體液進行監測，可為疾病的早期診斷提供有效的信息和證據。

2.2 靶向治療 當前治療非轉移性UTUC 的金標準是根治性腎-輸尿管-膀胱壁內段切除術。對于早期或低度惡性 UTUC 患者，行根治手術可能存在過度治療風險[49]。對于根治術后對側尿路系統復發的病人治療手段更有限，若保留尿路的治療效果欠佳。在綜合治療方面，已有多中心在開展以吉西他濱聯合順鉑為主的化療，進行UTUC 術后輔助化療研究，但因為化療藥物本身所具毒性，其療效仍存在爭議[50]。而其余治療方式（如內鏡下切除等）療效也不確切，缺乏不同類型患者及疾病亞型的高質量證據[51]。靶向分子標志物可調節血管再生、信號傳導、免疫系統及細胞凋亡。目前，臨床上缺乏可用于UTUC 治療的靶點，無法實現個體化醫療，因此探尋相關分子標志物和深入研究相關基因的致病機制將為篩選UTUC的精準治療靶標奠定堅實基礎。

2.3 預后監測 由于UTUC 多呈患側多中心發展且很少累及對側的臨床特征，在行單純腎輸尿管切除術后，周圍殘存尿路上皮易再次復發腫瘤。UTUC 患者即便行根治術后，仍有較大可能出現復發或轉移[6-8,49]。亟需能精確評估患者復發及轉移可能的監測手段，以獲得更加實用的治療方案和隨訪策略。如能在尿液或外周血中找到高敏感度、高特異度的分子標志物組合，將對UTUC 預后監測意義重大。

3 LB 在UTUC 的局限

盡管目前已發現一些與UTUC 發生、發展及預后相關的生物學標志物，由于UTUC 發生發展中伴隨著不同基因變異，相關基因發揮生物學功能的過程及調控是由基因、調控因子和蛋白質等多種生物分子途徑的相互作用形成，且既往研究結果還受研究設計、納入排除標準、樣本量大小、患者個體差異（遺傳異質性、所處環境不同）、疾病分級分期不同等因素影響，所發現的分子標志物種類不盡相同，因此評估疾病狀態可靠性較差，用于診斷時靈敏度和特異度不高，難以應用于臨床實踐。鑒于現有UTUC 分子標志物研究層面單一、種類稀少、重復性差，僅依靠單因子的預測模型無法完全滿足臨床診療需求，必須運用系統生物醫學的理論和技術，將LB 聯合患者病歷信息，建立多指標聯用的診斷模型，以提高診斷的靈敏度及特異度，對改進UTUC 診斷體系、實現早期診斷、靶向治療、預后監測具有重要的意義。

4 結語

LB 可應用于癌癥診治的所有階段，實現無創便捷監測疾病發展，可為UTUC 的診療提供新的思路。隨著LB 的不斷成熟和發展，有望對UTUC 患者實施精準診治，實現真正意義上的個體化治療。