淺談新型冠狀病毒疫苗的研發

朱飛 崔艷慧 潘頻華

中南大學湘雅醫院呼吸與危重癥醫學科，長沙410008

冠狀病毒是1937年從雞身上分離出來[1]。1965年，Tyrrell等[2]從普通感冒患者鼻洗液中分離出一株病毒，命名為B814病毒。Hamre等[3]用人胚腎細胞分離到類似病毒，代表株命名為229E病毒。1967年，Mclntosh等[4]用人胚氣管培養從感冒患者中分離到一批病毒，其代表株是OC43株。1975年，國際病毒命名和分類委員會正式命名了冠狀病毒科。冠狀病毒主要感染鳥類和哺乳動物，并僅限于其天然宿主，難以跨越物種屏障，在早期并未發現動物冠狀病毒感染人類的相關報道[5]。2002-2003年間SARS爆發流行，感染人數達8096例，全球有774例死亡病例[6]。2012-2019年，全球報告了2 494例實驗室確診中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-Co V)感染病例，其中有858例死亡病例[7]。冠狀病毒的跨物種傳播帶給人類慘痛的教訓。時至今日，新型冠狀肺炎(COVID-19)全球性的爆發流行再次給人類敲響警鐘。

1 冠狀病毒概述

冠狀病毒是一種單股正鏈RNA的包膜病毒，基因組長度為26～32 kb，是基因組最長的RNA病毒。冠狀病毒根據其遺傳物質和抗原可分為四大類：α-冠狀病毒、β-冠狀病毒、γ-冠狀病毒以及δ-冠狀病毒[8]。目前在人與人之間傳播的冠狀病毒有HCo V-OC43、HCo V-229E、HCo VNL63、HCo V-HKU1、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARSCo V)、MERS-Co V及最近發現的新型冠狀病毒，即嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-Co V-2)，其 中HCo V-229E、HCo V-NL63屬于α-冠狀病毒，而HCo V-OC43、HCo V-HKU1、SARS-Co V、MERS-Co V和SARS-Co V-2屬于β-冠狀病毒，后3種β-冠狀病毒傳染性極強，為人畜共患病毒[9]。冠狀病毒基因組編碼4個主要的結構蛋白：刺突(S)蛋白、核衣殼(N)蛋白、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白[10]。S蛋白介導病毒與宿主細胞表面受體結合，促使病毒進入受體細胞[11]。N蛋白的主要功能是結合冠狀病毒RNA，組成核衣殼[12]。M蛋白是結構最為豐富的蛋白，可以定義病毒包膜的形狀[13]，也被認為是冠狀病毒的主要組裝者，與其它所有冠狀病毒蛋白相互作用[9]。E蛋白是主要結構中最小的蛋白，復制周期中在感染者體內的細胞大量表達，但只有一小部分參與病毒包膜的構建[10]，大部分E蛋白定位在細胞內的運輸中心，如內質網和高爾基體[15]。

SARS-Co V-2在冠狀病毒的系統樹上與SARS-Co V密切相關[16]，SARS-Co V-2與SARS-Co V和BAT-Co V的基因組序列同源性分別為79.6%和96%[17]，國際病毒分類委員會將其命名為SARS-Co V-2。SARS-Co V-2是一種球形包膜病毒，直徑50～200 nm，其基因組長度為30 kb[18-19]，推測SARS-Co V-2有10～12個開放閱讀框(open reading frame，ORF)[20]。SARS-Co V-2基因組編碼的四種結構蛋白中，S蛋白對SARS-Co V-2的附著和進入宿主細胞起重要作用[19]。在感染過程中，三聚體的S蛋白會被裂解成亞基S1和S2，S1亞基含有受體結構域(receptor binding domain，RBD)負責和受體結合，S2則負責與膜融合[21]。SARS-Co V-2的S蛋白和SARS-Co V S的結合受體一樣，都是通過結合宿主細胞的血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)受體[19]進入宿主細胞。Wrapp等[18]通過3D結構分析表明，與SARS-Co V相比，SARS-Co V-2與ACE2受體的親和力更高。

2 SARS-CoV-2疫苗的研發策略

S蛋白、N蛋白、M蛋白和E蛋白是冠狀病毒的包膜蛋白，位于病毒表面，理論上都能產生中和抗體保護機體。在SARS-Co V或MERS-Co V基因組編碼的蛋白中，S蛋白是主要的病毒抗原成分，可誘導抗體產生，從而阻斷病毒結合，刺激宿主免疫反應，故以S蛋白作為疫苗開發的主要目標。對于SARS-Co V-2，用單克隆抗體進行的研究表明，感染SARS-Co V-2的患者對S蛋白，特別是S蛋白RBD，產生了強大的中和抗體反應[22-23]。在SARS-Co V疫苗的研究中，已經針對S蛋白開發出了亞單位疫苗、重組載體疫苗和DNA疫苗等。借鑒早期SARS-Co V和MERSCo V疫苗的研發經驗，Tostanoski等[24]利用26型腺病毒作為載體導入SARS-Co V-2S蛋白相關基因，構建穩定表達S蛋白的26型腺病毒載體疫苗，在倉鼠動物模型中該疫苗單次免疫可誘導結合和中和抗體反應，并對SARS-Co V-2導致的體質量減輕和肺炎具有保護作用，降低病死率。陳薇教授團隊同樣以腺病毒為載體，開發出表達SARS-Co V-2S蛋白的復制缺陷Ad5載體疫苗，并表明黏膜接種Ad5-nCo V可以完全保護小鼠的上呼吸道和下呼吸道免受SARS-Co V-2感染[25]。單次肌肉接種Ad5-nCo V可保護小鼠肺部免受SARS-Co V-2感染，并顯著減少病毒在小鼠和雪貂上呼吸道的復制。目前，Ad26疫苗和Ad5-ncov疫苗均已進入Ⅲ臨床試驗。

除了S蛋白，對SARS-Co V的早期研究表明，大多數感染者對N蛋白產生了抗體應答[26]。然而，接種表達N蛋白的疫苗不會對SARS-Co V攻擊產生保護作用，還會增加感染，其特征是肺內嗜酸粒細胞浸潤增加[27]。同樣，接種了表達N蛋白的重組痘苗病毒的BALB/c小鼠在隨后的SARS-Co V感染時觀察到病毒感染增強[28]。以上研究均表明N蛋白不適合作為疫苗靶標。

盡管已證明SARS-Co V患者血清對M蛋白有反應，由于免疫原性較低，M蛋白作為疫苗靶標的可能性較低[29]。有研究表明可以將E蛋白為靶標開發疫苗[16，30]。E蛋白參與MERS-Co V的毒力構建，敲除E蛋白的編碼基因可導致病毒毒力減弱。Almazan等[16]研究表明缺失E蛋白的MERS-Co V仍具有復制能力，但傳播能力有缺陷。在敲除E蛋白基因的SARS-Co V中也觀察到類似現象[32]。這為SARS-Co V-2疫苗的開發提供了另一種思路，可以通過對E蛋白的基因進行編輯獲得減毒病毒，但對于其用于減毒疫苗的制備及其安全性還有待進一步研究。

除了以結構蛋白為靶標開發疫苗外，還可開發多表位疫苗。多表位疫苗是一種同時攜帶多個抗原表位的疫苗，這類疫苗可以和不同型別的MHC分子結合，實現高效提呈，并可誘導很強的細胞免疫。有研究發現處于恢復期的SARS-Co V感染者的抗體應答是短暫的[31]，而T細胞免疫可以提供長期保護[32-33]，所以研制出多表位疫苗對于SARS-Co V-2防治也有著重要作用。Baruah和Bose[34]通過生物信息分析在SARS-Co V-2表面糖蛋白鑒定出5個CTL表位、3個連續的B細胞表位以及5個不連續的B細胞表位，發現除了CTL表位-VVNQNAQAL與SARS-Co V的相同外，與BAT-Co V，SARS-Co V和MERS-Co V相比，所有鑒定出的連續CTL和B細胞表位對于SARS-Co V-2是唯一的，而CTL表位-EPVLKGVKL與其他冠狀病毒的相應序列都不匹配。Ahmed等[35]則分析那些已經被實驗室確定的SARS-Co V的B細胞和T細胞表位，發現只有23%的T細胞表位和16%的B細胞表位可在SARS-Co V-2中找到，并且沒有突變。在這些表位因病毒基因組突變被取代前，制備出SARS-Co V-2相關疫苗才能有效遏制SARSCo V-2的傳播。

借鑒早期SARS-Co V和MERS-Co V的開發經驗，SARS-Co V-2疫苗的研發進展迅速。截至2020年12月10日，WHO公布全球共有52種SARS-Co V-2候選疫苗進行臨床評估，其中有13種候選疫苗進入Ⅲ期臨床試驗，162種SARS-Co V-2候選疫苗尚在臨床前試驗[36]。

3 疫苗研究中所面臨的問題

3.1 冠狀病毒的變異 冠狀病毒為RNA病毒，由于RNA聚合酶沒有校正機制，導致很高的錯誤突變率，這種突變可能加速病毒變異。有研究發現，在2002-2003年SARSCo V的流行期間，SARS-Co V發生突變以便于更好結合到宿主細胞受體并在宿主細胞中復制，從而增強毒力。而MERS-Co V自發現以來并未發生實質性突變，可能是因為MERS-Co V結合的功能性受體CD26是獨特的，所以病毒在健康宿主中發生突變的潛力有限[37]。Rahman等[38]以SARS-Co V-2武漢-HU-1株的全基因組序列為參考，通過非同義突變分析從全球共享所有流感數據庫(GISAID)中經處理得到35750個全長S蛋白基因序列，發現27

801株(77.77%)SARS-Co V-2變異株。同時，該團隊發現SARS-Co V-2S蛋白共有988個獨特的氨基酸替換，分布在660個位點，其中有11個高度可變的位點：32、142、146、215、261、477、529、570、622、778、791、1146、1162。在第614位出現了2個變異體即D614和G614，而在74.82%(n=26749)的序列中發現了D614G。D614G突變出現于COVID-19流行的早期，Zhang等[39]的研究表明D614G的突變增加了SARS-Co V-2S蛋白的密度及傳染性。該突變的頻率迅速增加已成為全球病毒的主導形式[38，40]。Weissman等[41]的研究表明接種了SARS-Co V-2疫苗的小鼠、非靈長類動物和D614變異SARS-Co V-2的免疫原的人類可產生中和抗體來中和帶有G614突變與D614突變的SARS-Co V-2S蛋白，這表明G614突變或D614突變的SARS-Co V-2并不能逃脫中和。Weissman團隊的研究結果緩解了對于SARS-Co V-2突變的擔憂，但依舊警惕未來病毒的變異導致相關疫苗的作用減弱等。

3.2 動物模型的選擇 由于SARS-Co V-2的S蛋白和SARS-Co V的S蛋白都可以通過結合宿主細胞ACE2受體介導病毒感染，理論上用于研究SARS-Co V免疫應答機制的動物模型也可用于SARS-Co V-2疫苗的研究。早期用于研究SARS-Co V的動物模型已經有恒河猴、小鼠、貓、敘利亞金色倉鼠和雪貂等，而用于SARS-Co V疫苗評價的包括小鼠和恒河猴[42]。曾經被用于SARS-Co V感染研究的小鼠模型包括BALB/c、C57BL6(B6)和129Sv Ev譜系小鼠[43-45]。但Zhou等[46]的研究表明SARS-Co V-2可與人、中國馬蹄蝙蝠、麝貓或豬的ACE2受體結合，但不能和小鼠的ACE2受體結合。Shang等[47]的研究表明ACE2受體上和S蛋白RBD結合的關鍵位點為第31位和第353位的賴氨酸殘基位點。而小鼠ACE2受體的第82位點和第353位點的殘基與人類的ACE2受體的不一樣，導致了SARSCo V-2的S蛋白不能結合小鼠的ACE2受體[48]。目前，有2種方法可使小鼠感染SARS-Co V-2。第一種是通過SARSCo V-2在BALB/c小鼠的肺部連續傳代，直到病毒S蛋白RBD適應于小鼠ACE2受體[49]。Wang等[50]采用該種方法得到了小鼠適應性病毒HRB26 M，該病毒能有效感染BALB/c小鼠和C57小鼠的上呼吸道和下呼吸道，并導致肺部病變。第二，利用基因工程技術建立表達人ACE2受體的小鼠模型或對S蛋白RBD進行改造，使小鼠感染SARS-Co V-2[51]。早在MERS-Co V相關研究中，小鼠不表達人類二基肽酶4受體[52]。Zhao等[53]則利用轉基因技術建立表達人類二基肽酶4受體的小鼠模型，該模型在感染MERS-Co V后表現出急性呼吸道損傷及肺外器官損傷。Sun等[54]最近利用CRISPR/Cas9技術開發了一種表達人ACE2受體的轉基因小鼠模型，將人ACE2受體cDNA敲入小鼠ACE2位點。這個模型對SARS-Co V-2感染高度敏感。然而，小鼠在感染SARS-Co V-2后的體質量減輕和肺部病變比較輕微。

除小鼠外，敘利亞倉鼠也被認為是對SARS-Co V-2高度易感的臨床前模型。Rosenke等[55]的研究表明敘利亞倉鼠對SARS-Co V-2高度易感，并可導致中到重度支氣管間質性肺炎。另外兩項研究表明在實驗性鼻腔感染后，敘利亞倉鼠可表現出輕到中度的臨床癥狀，并在感染后很早(接種后1～2d)就出現進行性體質量下降。所有受到不同SARS-Co V-2分離株感染的倉鼠都一直顯示出呼吸窘迫的跡象，包括呼吸困難[56-57]。

早期研究表明，恒河猴、非洲綠猴和食蟹獼猴可感染SARS-Co V，并可在這些不同種非人類靈長動物中發現病毒感染后的肺炎征象[58-60]。Lu等[61]的研究表明恒河猴、食蟹獼猴和普通恒河猴可感染SARS-Co V-2，且在肺部均觀察到了肺損傷和其他組織病理學異常，而恒河猴和食蟹獼猴的肺損傷更為明顯。同樣，最近有研究證明非洲綠猴是適用于SARS-Co V-2的非人類靈長類動物模型[62]。然而，面對眾多的候選藥物和疫苗，非靈長類動物的供應有限，這使得它們成為一種更加寶貴的資源。因此，可通過較小的哺乳動物模型優先測試藥物，以證明其耐受性和有效性。小鼠、敘利亞倉鼠是目前比較合適的用于評估疫苗效果的小動物物種。但與小鼠相比，用于疫苗評價及研究的敘利亞倉鼠模型依舊較少。然而，不同小鼠模型感染SARS-Co V-2所表現出的臨床癥狀并不能完全反映人類感染SARS-Co V-2出現的臨床癥狀，所以對于疫苗的臨床前實驗研究，則需要多種動物模型聯合評估疫苗的效果。

3.3 抗體依賴性增強作用(antibody-dependent enhancement，ADE) ADE是病毒的疫苗設計及抗體類藥物制備考慮的主要問題之一。ADE早期受關注是因為SARS患者的血清轉化及中和抗體反應與患者臨床癥狀嚴重程度及病死率密切相關[63]。而COVID-19患者中也有類似發現，更高的抗SARS-Co V-2抗體滴度與更嚴重的疾病密切相關[64]。ADE在病毒感染中主要通過2種機制發生。(1)通過抗體Fc段與靶細胞Fc受體結合，促進表達Fcγ受體ⅡA的免疫細胞對病毒的攝取，使病毒進入免疫細胞，并在細胞內復制和擴散，導致感染增強。(2)病毒與抗體結合激活補體途徑，形成病毒-抗體-補體復合物。該復合物與細胞表面補體受體結合，促進病毒內化與感染增強。當低滴度的非中和抗體或亞中和抗體不再發揮中和作用時，這兩種ADE的途徑都有可能發生[65]。在SARS-Co V疫苗的開發過程中，Kam等[66]發現了包含全長S蛋白的VLP疫苗存在抗體依賴性感染增強的現象。Wan等[67]通過體外細胞實驗證明MERS-Co VRBD的特異性中和單克隆抗體MAb(Mersmab1)可模仿病毒受體介導MERS-Co V的ADE現象產生。Luo等[68]用SARS-Co V滅活病毒疫苗建立了低中和抗體水平的恒河猴模型，并用SARS-Co V感染該模型，卻并未見到病毒復制增強。另一項研究中，Wang等[69]用SARS-Co VS蛋白的4個B細胞多肽表位免疫獼猴后，發現其中3種多肽可誘導抗體保護獼猴免受病毒攻擊，另一種多肽則明顯增強細胞及獼猴SARS-Co V的感染，并導致獼猴出現更嚴重的肺損傷。因此，關于ADE相關的研究結果有很大的差異，這可能與疫苗的策略有關。理論上誘發病理性ADE的疫苗如滅活病毒疫苗，可能含有非中和抗原靶點和/或非中和構象的S蛋白，為抗體提供了大量非保護性靶點，這些抗體可能通過對其他呼吸道病原體觀察到的機制引發額外的炎癥。因此，以S蛋白中和抗原靶點的表位設計為表位疫苗以減少非中和抗體的產生，可能是解決這一問題的潛在方向之一。另一種降低ADE發生風險的潛在方向為提高中和抗體的效價。Liu等[70]發現Fc融合蛋白可顯著增強SARS-Co V-2RBD免疫原誘導的中和抗體滴度，佐劑MF59可進一步增強RBD-Fc融合蛋白的抗原性，降低ADE的發生風險。

4 總結

全球COVID-19疫情仍在繼續，快速開發SARS-Co V-2疫苗已成為當務之急。目前，全球已經有200多種疫苗處于研發中，有13種候選疫苗進入Ⅲ期臨床試驗，這讓我們看到了結束疫情的希望。目前，尚有162種SARS-Co V-2候選疫苗處于臨床前試驗，仍然需要考慮SARS-Co V-2疫苗研制中所存在的問題，如ADE現象、病毒的突變、動物模型的選擇等。除此之外，表位疫苗的表位選擇、疫苗佐劑的選擇、疫苗的效果評價等問題也不能忽視，期待不久后研發出更加安全有效的疫苗以應對COVID-19疫情。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突