肝衰竭合并侵襲性真菌病的診斷策略*

李 麗 李秀惠 陳 煜

1.首都醫科大學附屬北京佑安醫院中西醫結合中心 (北京， 100069) 2.首都醫科大學附屬北京佑安醫院疑難重癥肝病及人工肝中心

肝衰竭是由多種原因引起的嚴重肝功能損傷，病死率高。肝衰竭患者在病程中常常出現免疫功能抑制[1]，且應用抗菌藥物、糖皮質激素也很常見，侵襲性真菌病(IFD)的發生機會顯著增加。由于真菌感染臨床癥狀不典型，且常與細菌感染并存，診斷困難，治療周期長、難度大，病死率更高。早期診斷、及時治療成為改善肝衰竭合并IFD預后的關鍵。筆者梳理了肝衰竭合并IFD的診斷策略，為臨床醫生提供參考。

1 肝衰竭合并IFD的流行情況

IFD是指真菌侵入人體，在組織、器官或血液中生長、繁殖，并導致炎癥反應和組織損傷的感染性疾病[2]，文獻報道肝衰竭合并IFD的發生率為2%～15%[3]，病原學以白色念珠菌和曲霉菌為主[4]，感染部位以肺部和口腔為主[5]。最近國內有報道分析了2008至2017年某醫院3 233例符合肝衰竭診斷的患者，其中合并真菌感染患者372例(11.5%)，病原學主要菌屬為念珠菌(占55.92%，其中白色念珠菌占35.92%)和曲霉菌(占42.85%，其中煙曲霉菌占34.69%)，隱球菌和毛孢子菌僅分別占0.82%和0.41%。呼吸道感染占60.05%，口腔感染占29.91%，其次依次為泌尿道(4.34%)、腹腔(2.97%)、消化道(1.14%)、胸腔(0.68%)、血液(0.68%)、膽道(0.23%)[6]，國內其他報道的感染部位分布結果類似。肝衰竭合并IFD的28 d病死率達56%，90 d病死率可達71%，預后極差[7]。

2 肝衰竭合并IFD的危險因素

對于重癥患者，目前公認的IFD危險因素包括宿主和治療方面[8, 9]。宿主方面的危險因素包括：①年齡>65歲；②合并重要臟器功能不全，如肝硬化、腎功能不全、腸功能減退、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病等；③存在念珠菌定植。治療方面的危險因素包括：①侵入性操作：機械通氣、動靜脈置管、留置尿管及其他引流管、血液凈化治療等；②藥物治療：長期使用3種以上廣譜抗菌藥物、糖皮質激素治療等。

需要指出的是，在歐美國家的指南中，上述危險因素不被認為是診斷IFD的依據[9]。作為臨床診斷條件的宿主因素主要包括存在免疫缺陷或免疫抑制的以下情況：①中性粒細胞減少<0.5×109/L 持續超過10 d；②過去60 d內采用糖皮質激素治療(≥0.3 mg/kg)3周以上；③過去90 d內接受T細胞免疫抑制治療；④接受B細胞免疫抑制治療；⑤血液病；⑥干細胞或實體器官移植受體；⑦先天性嚴重免疫缺陷；⑧移植物抗宿主反應(Ⅲ或Ⅳ級累及消化道、肺、肝且一線糖皮質激素治療無效)。

包括肝衰竭在內的重癥或終末期肝病普遍被認為存在免疫缺陷[10]，但尚不能作為診斷IFD的宿主因素。越來越多證據表明，肝衰竭自身特點是發生IFD的獨立危險因素，包括腹水白蛋白水平<1 g/dl、高MELD評分、高CTP評分、合并腎功能損傷、ICU治療、血管或腹腔內置管等[10]。以上情況需要警惕患者發生IFD的可能性，并及時尋找證據，早識別、早診斷、早治療。

3 肝衰竭患者的早期識別

當肝衰竭患者臨床出現以下情況時應考慮IFD發生的可能性[10]：①使用廣譜抗菌素治療后體溫得到控制而后復升，或使用廣譜抗菌素治療48～72 h無效；②口腔黏膜真菌感染伴全身感染癥狀；③外周血白細胞及中性粒細胞比例升高，廣譜抗菌素治療無效；④肝硬化患者病情遷延或加重；⑤肺實變及肺浸潤性改變、抗菌素治療無效。需進一步尋找真菌感染證據。

4 肝衰竭合并IFD的診斷方法

考慮到IFD感染的可能性，可進行以下檢測方法尋找病原。

4.1 實驗室檢查

4.1.1 真菌抗原檢測 真菌抗原檢測是真菌感染無創、早期診斷的重要血清學篩選指標，主要包括1,3-β-D葡聚糖(BDG)、半乳甘露聚糖(GM)。①BDG試驗(G試驗)。BDG廣泛存在于各類真菌(毛霉菌和隱球菌除外)細胞壁，占胞壁成分50%以上。當真菌進入人體，經吞噬細胞吞噬、消化后，釋放BDG，血液或其他體液中即可檢測到BDG[11]。G試驗對除隱球菌和毛霉菌以外的所有深部真菌感染的早期診斷非常有幫助，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。G試驗檢測陽性最早可于臨床癥狀出現前4 d，或發熱前5 d被檢測到，是早期檢測的重要手段[12-15]。目前文獻報道中常用的BDG檢測試劑盒包括Fungitell、Glucatell 試劑盒(主要用于歐美國家)，Fungitec-G 、Wako 試劑盒(主要用于日本)，Dynamiker Fungus試劑盒(主要用于中國)。最近一項系統綜述對不同試劑盒檢測免疫缺陷或危重患者真菌感染的準確性進行了分析，根據推薦的截斷值(cut-off)水平，真菌檢測的敏感性為 27%～100%，特異性0% ～100%。各研究之間產生異質性的原因包括試驗設計、目標人群、真菌類型、抽樣誤差、檢測截斷值等因素，未來需要更多研究改善異質性，提供可靠的敏感性和特異性結果[16]。②GM試驗。GM分布于大多數曲霉及青霉屬真菌胞壁中，是曲霉菌檢測的特異性分子標志物。GM試驗方法主要是酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，是IFD尤其是侵襲性曲霉菌病(IA)的篩選試驗，適用于具有IFD高危因素的成人或兒童患者。IA患者血清GM陽性早于臨床表現和影像學改變，連續GM試驗動態監測具有早期診斷價值。肺泡灌洗液的GM試驗比血的GM試驗數值對診斷曲霉菌感染具有更高的特異性和敏感性[17, 18]。GM>0.5時敏感性可達100%，特異性超過75%[19, 20]。

4.1.2 熒光定量PCR檢測真菌DNA 熒光定量PCR檢測血液中的真菌已經有大量報道[21, 22]，實時熒光PCR檢測血清樣本曲霉DNA可協助診斷肝衰竭合并IA。新鮮組織標本可用于毛霉核糖體DNA(rDNA)小亞基半巢式 PCR 檢測，呼吸系統活檢標本PCR 結果的敏感性優于組織病理檢查和真菌培養[23]。由于實驗室檢查PCR的技術尚未標準化，商業檢測試劑盒還未得到廣泛應用，目前PCR檢測沒有被納入EORT/MSG的推薦意見。

4.1.3 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒定技術檢測真菌胞內核糖體蛋白 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術，簡稱飛行質譜技術，是臨床微生物鑒定領域的重要技術手段。其機制在于每種微生物自身具有獨特的肽/蛋白質，MALDI-TOF MS用來檢測微生物胞內核糖體蛋白，經系統處理后得到與蛋白成分對應的質譜峰圖，然后與數據庫內菌株的參考質譜峰圖進行比對，根據譜圖相似程度對微生物進行菌種鑒定。MALDI-TOF MS已應用于細菌、酵母菌、絲狀真菌菌種的鑒定，可在幾分鐘之內完成對微生物種、屬水平的鑒定[24-26]。MALDI-TOF MS具有快速、準確、高通量、低成本的優勢[27, 28]。由于真菌本身的復雜性以及現有數據庫內真菌菌種涵蓋范圍有限，其鑒定能力還有待提高。

4.1.4 體液直接鏡檢、涂片和真菌培養 各種體液可進行直接鏡檢、涂片或培養發現真菌。體液標本包括血液、正常無菌部位的穿刺液、呼吸道分泌物、尿液、各種引流液(胸腹水、腦室引流液)。對于血液、無菌腔液或組織液進行涂片并染色，可快速發現真菌[29, 30]。毛霉素鏡下特征表現為寬度不一、無隔或少隔的絲帶狀菌絲體。雙相真菌(如馬爾尼菲藍狀菌)鏡下可見“臘腸樣”菌體，不著色橫隔是馬爾尼菲藍狀菌的典型特征。懷疑隱球菌腦膜炎者，應進行腦脊液的印度墨汁染色，鏡下未染色的莢膜是隱球菌的特征。卡氏肺孢子菌不能通過體外培養獲得，主要依靠肺泡灌洗液直接涂片進行六胺銀染色診斷。體液真菌培養陽性者，需進一步進行真菌屬、種的鑒定。

4.2 組織病理學檢查 感染部位病理組織找到真菌病原體是診斷IFD的金標準。通過切片、染色觀察真菌的形態和組織反應。常用染色方法包括革蘭染色、HE染色、姬姆薩染色、PAS染色、嗜銀染色(GMS)、黏蛋白卡紅(MCS)染色、Gridly真菌染色(GF)等[31]。根據組織中發現的病原體及局部組織反應判別是致病菌或定植菌，組織反應的基本病理改變包括急慢性化膿性炎癥、非化膿性炎癥、肉芽腫形成、干酪樣壞死、血管炎等。凝固性壞死較多見于曲霉菌和念珠菌感染，毛霉菌和新生隱球菌肺炎常出現楔形梗死灶[32]。臨床懷疑 IFD 時，盡量多次抽血、無菌腔液進行真菌培養，盡可能行組織病理檢查協助診斷。但重癥肝病患者常由于凝血時間延長難以獲得組織標本，同時真菌培養時間長、陽性率低，早期確診仍是挑戰。

4.3 影像學檢查 影像學檢查是診斷IFD的重要手段，有助于判斷感染部位、感染類型、病灶數量、大小、局部浸潤，可在CT引導下行穿刺活檢。高分辨CT(HRCT)對于IA有重要意義。典型表現為伴或不伴暈征的結節病灶(>1 cm)或楔形壞死病灶，結節中出現新月征和空洞形成，是曲霉菌侵犯肺部的臨床診斷標準。感染還可累及肺泡和細支氣管壁，表現為支氣管周圍實變影、支氣管擴張征、小葉中心型微小結節影、樹芽征和毛玻璃樣改變等表現，為曲霉菌氣道侵襲的特征性表現[32]。毛霉病患者影像學檢查可出現反暈輪征，有研究表明，19%的毛霉病患者出現反暈輪征，而僅<1% 的曲霉病患者出現類似的改變。

5 肝衰竭合并IFD的診斷

目前國內外尚無關于肝衰竭合并IFD診斷標準的指南或共識，可參考2007年中華醫學會重癥醫學分會制訂了《重癥患者侵襲性真菌病診斷與治療指南(2007)》[8]，以及國外《EORTC/MSG侵襲性真菌病指南》2019年更新版[9，33]。國內外均將IFD的診斷分3個級別：確診、臨床診斷、擬診，診斷依據包括宿主因素、臨床特征、微生物學檢查、組織病理學4部分。上述國內外指南對于宿主因素的界定有所不同，國外診斷標準對宿主因素做了嚴格限定，國內指南則將危險因素、宿主因素合并成為危險(宿主)因素，而肝衰竭發生IFD的獨立危險因素是否應當列入指南仍有待于形成統一意見。

5.1 確診

5.1.1 霉菌感染 具有以下情況之一可確診為霉菌感染。①針吸或活檢獲得的組織病理、細胞病理或直接鏡檢，可見菌絲或產黑色素酵母樣真菌并伴有組織損傷證據；②正常無菌部位由臨床或影像學發現感染病灶，無菌操作下獲得標本培養得到透明或黑色霉菌(不包括肺泡灌洗液、鼻旁竇、乳突竇、尿液)；③血培養得到真菌，如鐮孢菌等(曲霉菌多為污染菌)；④石蠟病理切片發現霉菌，行PCR真菌DNA擴增及DNA測序確定。

5.1.2 酵母菌感染 具有以下情況之一可確診為酵母菌感染。①正常無菌部位針吸或活檢取得的標本進行組織病理、細胞病理或直接鏡檢可見酵母菌細胞，如帶有莢膜、出芽的隱球菌，有菌絲或假菌絲的念珠菌；②無菌部位由臨床或影像學發現感染病灶，無菌操作下獲得標本(包括24 h內引流液)，培養得到酵母菌；③血培養：酵母菌(如隱球菌或念珠菌)或酵母樣菌(毛孢子菌)培養陽性；④腦脊液或血清隱球菌抗原陽性；⑤石蠟病理切片發現酵母菌，行PCR真菌DNA擴增及DNA測序確定。

5.1.3 其他真菌感染 ①肺孢子菌：組織、肺泡灌洗液、痰液進行傳統或免疫熒光染色可見肺孢子菌；②地方性真菌病：感染部位標本的病理學或直接鏡檢可見特征性真菌；感染部位標本培養發現特異性真菌；血培養發現特異性真菌。

5.2 臨床診斷 做出臨床診斷需要綜合宿主因素、臨床特征、真菌微生物學檢測結果。要求至少具有1項宿主因素，具有可能感染部位的臨床特征(包括癥狀、體征、影像學表現)，并同時具備至少1項以下真菌微生物學檢測結果陽性[8]。①血液、胸腹水等針吸無菌體液涂片發現隱球菌以外的真菌；②留置導尿、連續2份尿檢見念珠菌管型或尿培養呈酵母菌陽性；③直接導尿獲得的尿樣培養呈酵母菌陽性(尿念珠菌>103CFU/ml)；④更換尿管前后2份尿樣培養呈酵母菌陽性(尿念珠菌>103CFU/ml)；⑤氣道分泌物(包括經口、氣管插管、支氣管肺泡灌洗、保護性標本刷獲取的標本)直接鏡檢/細胞學檢查發現菌絲/孢子或真菌培養陽性；⑥經胸、腹、盆腔引流管等留取的引流液直接鏡檢/細胞學檢查發現菌絲/孢子或真菌培養陽性；⑦經腦室引流管留取的標本直接鏡檢/細胞學檢查發現菌絲/孢子或真菌培養陽性；⑧連續2次血液標本GM試驗和/或G試驗檢測陽性。

5.3 擬診 具有1項宿主因素，具備1項上述真菌微生物檢測結果陽性或者僅具有可能感染部位的臨床特征。

6 中醫對肝衰竭合并IFD的認識

目前真菌感染的中醫辨證報道較少，肝衰竭(重型肝炎)合并IFD辨證分型的報道則更少。中醫認為肺部真菌感染當屬“咳嗽”、“肺痿”、“肺脹”、“虛勞”、“風溫”等病范疇[34]。關于其證型，可分為虛實兩證，虛證以陰虛、氣陰兩虛為常見，實證多表現為風溫之邪侵襲肺體[35]。肺念珠菌病可分為痰濕郁肺、痰熱蘊肺、肺陰虧虛型等證型[36]；肺霉菌感染可分為溫邪犯肺型及陰虛火旺型[37]。

王靈臺教授團隊對1996至2003年住院治療的74例重型肝炎并發真菌感染患者的中醫證候進行了分析，發現痰熱證、熱毒證及濕熱證與重型肝炎并發真菌感染有密切關系，提示中醫的痰熱證、熱毒證及濕熱證的出現是重型肝炎并發真菌感染的危險因素[38]。

7 總結

肝衰竭作為特殊的重癥疾病類型，由于患者凝血機制差，獲取病理確診較為困難，血培養以及臨床診斷更為重要，詳細分析患者的危險因素、早期識別臨床特征、及時進行血液/體液微生物學檢測是早期診斷的重要策略。而肝衰竭宿主因素作為真菌感染的診斷依據國內外尚未共識，有必要在未來加強臨床和基礎研究，為指南制定提供依據。