NLRP3炎癥小體在心肌缺血再灌注損傷中的研究進展

梁儀琳，陳虹燚，黃照河

(1.右江民族醫學院研究生學院，廣西 百色533000； 2.右江民族醫學院附屬醫院心血管內科，廣西 百色533000)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是內科急危重癥之一，目前我國AMI的發病率和病死率均呈不斷上升趨勢，給人們的身心健康造成嚴重威脅。打通罪犯血管、恢復心肌供血對于AMI患者非常重要，而早期、快速、有效的再灌注治療(如靜脈溶栓、經皮冠狀動脈介入治療、急診冠狀動脈旁路移植術)是救治AMI患者的關鍵。但血流再通、心肌重新恢復灌注后會出現心肌損害、心電功能障礙進行性加重的現象，這種現象被稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。MIRI嚴重影響AMI患者的轉歸，是造成AMI高病死率的危險因素之一，一直備受學者們的關注[1]。越來越多的研究表明，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體的表達水平與MIRI病情嚴重程度密切相關，NLRP3通過其亞單位胱天蛋白酶(caspase)1的活化，釋放出強勁的炎癥物質或開啟一種可控、有序的“細胞自殺”新模式——細胞焦亡，而加劇炎癥作用，導致MIRI心肌組織的進一步損傷[2-4]。作為炎癥反應的核心，NLRP3是目前探索比較深入的炎癥小體，且有可能成為治療MIRI的一個重要靶點。現就NLRP3炎癥小體在MIRI中的研究進展予以綜述。

1 NLRP3炎癥小體的組成及活化

1.1NLRP3炎癥小體的組成 先天免疫系統作為機體抵抗外來或內在威脅的第一道屏障系統，能通過模式識別受體識別內源性或外源性危險信號等刺激并做出防御反應，而炎癥小體是一種細胞內的模式識別受體，它通過細胞活化、釋放細胞因子及炎癥介質等引起炎癥反應，在抵御感染、維護免疫穩態中占據重要地位。炎癥小體大致可分為兩類，即核苷酸結合寡聚化結構域樣受體(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)蛋白家族和PYHIN(pyrin and HIN domain-containing)蛋白家族，其中被關注最多、最有特點的為NLRs家族中的NLRP3炎癥小體，NLRP3炎癥小體可識別許多不安全的信號，并在各種疾病條件下導致炎癥反應，參與機體免疫。

NLRP3炎癥小體的組裝首先通過凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)在中間架起橋梁，然后由傳感器NLRP3受體蛋白和效應器caspase-1前體蛋白組合形成[5]。NLRP3炎癥小體是一種蛋白質復合物，亦是NLRs家族成員之一。大多數NLRs家族均存在一個同源的三域結構：①N端功能結構域(包括熱蛋白結構域、caspase募集域和桿狀病毒抑制重復序列域)，可以召集下游因子傳送信號；②位于中間的核苷酸寡聚結構域，可識別配體；③C端亮氨酸重復區域[6]。NLRP3蛋白的特征為其N端熱蛋白結構域可通過同型相互作用招募ASC，進而通過caspase募集域同型相互作用征集caspase-1前體，完成NLRP3炎癥小體的組裝，促使caspase-1的活化和白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18的生成[7-8]。

1.2NLRP3炎癥小體的活化 NLRP3炎癥小體是人體免疫的重要調控者，它可以由各種激活劑觸發，主要包括：①內源性損傷相關分子模式，如細胞損傷后釋放的物質(ATP、高遷移率族蛋白B1、嘌呤代謝產物等)；②病原相關分子模式，如脂多糖、細菌、病毒等；③外源性刺激物，如強烈紫外線、鋁等[9]。目前 NLRP3炎癥小體的活化機制仍不明確，可能的機制包括：①線粒體活性氧類的產生；②ATP依賴的鉀離子外流；③自噬與溶酶體滲漏[10]。

NLRP3炎癥小體的活化分為兩個過程。①啟動：NLRP3炎癥小體識別危險信號，并通過核因子κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)通路啟動前體蛋白(包括NLRP3蛋白、前體IL-1β和前體IL-18)的表達；②觸發：非活性的NLRP3、ASC和前體caspase-1相互結合，觸發形成功能性NLRP3炎癥小體，從而導致caspase-1前體蛋白裂解；此時處于活性狀態的caspase-1對前體IL-1β和前體IL-18進行加工，使其轉化為成熟、強效的促炎因子并分泌到胞外[11-12]。另外，活化的caspase-1可切割分解GSDMD(gasdermin D)，GSDMD釋放出有打孔特性的N端結構域，N端結構域與磷脂結合在質膜上形成蜂窩狀的孔洞，導致細胞破裂觸發細胞焦亡，外溢的細胞內容物和IL加速了機體免疫防御反應，激活并放大炎癥反應，從而導致細胞和組織損傷加重[13]。

2 NLRP3炎癥小體與MIRI

2.1NLRP3炎癥小體在MIRI中的激活 MIRI是AMI血管再通治療過程中亟待解決的“瓶頸”問題，在國內外均備受關注。MIRI的機制比較復雜，主要與活性氧類大量生成、細胞內鈣離子超負荷、細胞凋亡以及中性粒細胞等炎癥細胞的浸潤有關，其中炎癥反應和炎癥介質的釋放伴隨MIRI發生、發展的整個過程[14]。干預炎癥反應的損傷性作用或下調炎癥因子的表達，對降低MIRI心肌二次傷害的程度、改善心臟功能均具有重要意義。NLRP3炎癥小體的活化及表達程度與MIRI疾病進展密切相關，但具體作用機制仍存在爭議。有證據指出，在MIRI中細胞缺氧導致的活性氧類累積可刺激產生硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)，而TXNIP與NLRP3的亮氨酸重復區域結合，可啟動和激發整個炎癥小體[15]。Liu等[16]研究發現，沉默MIRI小鼠的TXNIP基因可以減少氧化應激、梗死面積和NLRP3的激活，表明在心肌微血管內皮細胞中TXNIP觸發NLRP3炎癥小體可能導致MIRI的發生。TXNIP是一種功能多樣的蛋白質，通過抑制硫氧還蛋白系統的功能而發揮促進氧化應激、抑制細胞增殖及誘導細胞凋亡等作用，在MIRI中TXNIP能夠激活NLRP3炎癥小體，NLRP3炎癥小體活化可以進一步介導下游因子發揮作用，特別是caspase-1被激活后可發揮蛋白水解級聯功能而逐步放大炎癥反應，并誘導大量心肌細胞死亡，使再灌注的心肌損傷加重[17-18]。TXNIP在心肌微血管內皮細胞中的作用提示NLRP3炎癥小體在不同細胞中可能具有不同的作用機制。

另外，心臟成纖維細胞在MIRI中也扮演重要角色。Kawaguchi等[19]研究表明，心臟成纖維細胞能夠識別心肌細胞受損后釋放的內源性生物介質，從而激活NLRP3炎癥小體。此外，心肌組織缺氧損傷后釋放的大量ATP可激活細胞膜表面的嘌呤受體P2X7，導致陽離子通道被打開，大量鈣離子、鈉離子內流，使細胞內鉀離子水平降低，加速NLRP3炎癥小體的活化[20]。有文獻報道，串聯孔區弱內向整流鉀通道2(tandem of pore domains in a weak inward rectifying K+channel 2，TWIK2)蛋白可與P2X7受體合作完成NLRP3蛋白的組裝和激發，最終導致心肌損傷[21]。這是探索NLRP3炎癥小體在MIRI中激活機制的新成果，為尋找治療MIRI的新靶點奠定了分子基礎。

2.2NLRP3炎癥小體在MIRI中的調節 炎癥反應在MIRI發生、發展過程中扮演重要的角色。在心肌缺血再灌注過程中，多種分子在心肌細胞中表達，包括觸發宿主炎癥的模式識別受體，它能識別來源于損傷和壞死心肌的損傷相關分子模式，刺激機體免疫反應，而NLRP3炎癥小體屬于細胞內模式識別受體，NLRP3炎癥小體及其下游信號ASC、caspase-1以及IL-1β、IL-18等在MIRI發病過程中起重要作用[22]。Kawaguchi等[19]利用ASC敲除小鼠和caspase-1敲除小鼠建立MIRI模型發現，除中性粒細胞和巨噬細胞外，心肌缺血處成纖維細胞中的ASC水平顯著提高，與野生小鼠相比，敲除ASC和caspase-1小鼠炎癥反應和損傷(包括心肌梗死的發展、心肌纖維化和結構損傷)均明顯減少，提示ASC、caspase-1可能與再灌注損傷的致病機制有關。通過模擬小鼠MIRI實驗發現，心肌NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表達均上調；進一步抑制NLRP3炎癥小體可減輕病灶炎癥及心肌壞死，且小鼠的心肌功能障礙和梗死面積也均顯著改善[23-25]。上述動物實驗結果說明了NLRP3炎癥小體對MIRI的重要性，NLRP3炎癥小體作為一種新型免疫標志物在MIRI的診療中具有一定的臨床意義。在人體研究中也發現，NLRP3炎癥小體誘發釋放的下游炎癥因子IL-1β和IL-18在經皮冠狀動脈介入治療后缺血再灌注損傷患者中高表達[26]，提示通過干預相關炎癥損傷標志物，可以靶向NLRP3炎癥小體，減輕心肌損傷。

細胞焦亡作為一種可誘發炎癥反應并可調控的細胞死亡形式與MIRI疾病進展密切相關。Qiu等[27]通過糖尿病大鼠實驗發現，NLRP3炎癥小體介導的細胞焦亡在MIRI中具有關鍵的致病作用，通過抑制NLRP3炎癥小體能對抗心肌細胞焦亡，發揮減少心肌梗死面積和組織損傷、保護心臟的作用。鄭亞萍和劉春杰[28]通過結扎大鼠冠狀動脈造模實驗發現，MIRI可顯著升高NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β因子水平以及增加大鼠心肌梗死面積。由此可見，對這些因子以及心肌細胞焦亡進行調控可以很好地規避缺血和再灌注導致的心肌損傷。

另外，NLRP3還可獨立于炎癥小體發揮功能。Sandanger等[29]發現，與野生型和NLRP3敲除小鼠相比，ASC敲除小鼠MIRI轉歸并無顯著改善，說明NLRP3和ASC在MIRI心肌損傷方面的作用存在差異。Shigeoka等[30]在腎缺血再灌注損傷小鼠模型實驗中發現，NLRP3缺失小鼠的腎小管損傷和腎功能均顯著好轉，而ASC或caspase-1基因缺失小鼠的腎損傷無顯著改善。Inoue等[31]也發現，敲除NLRP3基因小鼠的肝缺血再灌注損傷顯著改善，而ASC基因缺失小鼠的肝臟損傷未見明顯改善。此外，有學者通過動物研究、細胞培養等實驗強調了NLRP3在非專業免疫細胞中的獨特作用，NLRP3可獨立于炎癥小體調節炎癥的不同方面，在心臟成纖維細胞分化和心肌纖維化發展中發揮重要作用[32]。這些研究揭示了NLRP3與ASC、caspase-1可不依賴于組裝形成的炎癥小體而單獨發揮作用，在各種類型細胞或組織中介導炎癥反應，推動疾病進程。

炎癥是機體防御的一種保護性反應，對組織修復以及防止致病因子持續攻擊均很重要，炎癥反應不足或過表達均會對機體產生不利影響。NLRP3炎癥小體在MIRI中具有保護作用還是致病作用目前仍存在爭議。有學者發現，在開胸和閉胸MIRI模型中NLRP3炎癥小體的表達完全不同，在開胸造模小鼠的心臟中可檢測到NLRP3蛋白，而在閉胸實驗中未檢測到NLRP3蛋白，表明閉胸造模可能減輕MIRI的炎癥反應，NLRP3炎癥小體的表達可能與開胸手術創傷應激相關，而與急性MIRI無關[33]。Sandanger等[34]結扎NLRP3基因敲除小鼠的左冠狀動脈后進行再灌注發現，NLRP3缺陷小鼠的心肌梗死面積較野生型小鼠大，表明在MIRI中NLRP3炎癥小體可能發揮積極的保護作用。

3 以NLRP3炎癥小體為靶點治療MIRI

NLRP3炎癥小體是MIRI后初始炎癥反應的關鍵分子機制之一，可誘導釋放的炎癥物質持續作用于缺血心肌，加速心肌結構損傷和功能障礙，因此以NLRP3炎癥小體為靶點治療MIRI可能是一個新途徑。MCC950、CY-09、OLT1177等在動物實驗中均被證明是有效的選擇性NLRP3抑制劑，可通過靶向抑制NLRP3炎癥小體的活化而發揮潛在的疾病防治作用，但這些均只停留在實驗尚未正式應用于臨床[24,35-36]。另外，P2X7受體可通過誘發NLRP3炎癥小體的活化參與MIRI，Granado等[37]給予MIRI大鼠P2X7受體拮抗劑后，其心肌中的抗凋亡標志物表達上調，心臟功能及能量代謝均顯著改善。可見，P2X7受體具有成為干預MIRI新靶標的潛能。秋水仙堿是最古老的抗炎藥之一，可通過抑制NLRP3活化，防止P2X7受體誘導的孔洞形成，限制鉀離子流出，從而發揮抗炎作用[38]；在大鼠MIRI模型實驗中發現，秋水仙堿處理組心肌梗死的進展及心肌纖維化等均顯著改善[39]。Marchetti等[40]發現，格列本脲合成途徑中的中間產物16673-34-0可通過降低NLRP3炎癥小體的表達水平限制小鼠MIRI后的梗死面積，因其不含與胰島素釋放有關的環己脲基團而對血糖無影響，因此小分子16673-34-0可能作為一種有拮抗NLRP3炎癥小體作用的新型藥物應用于MIRI的臨床防治中。NLRP3炎癥小體是MIRI發生、發展的重要驅動因子，靶向抑制NLRP3炎癥小體可能是減少MIRI心肌損傷的全新方法。NLRP3炎癥小體抑制劑的研發前景廣闊，但仍需進一步的臨床試驗評估其療效和安全性。

NLRP3炎癥小體的效應因子IL-1β和IL-18活化后即可觸發其他炎癥介質的釋放，擴大炎癥反應，直接參與心肌組織的進行性破壞。Toldo等[41]研究證實，重組人IL-1受體阻滯劑阿那白滯素可有效減小小鼠MIRI的梗死面積，改善心肌重構；在治療合并冠心病的類風濕關節炎患者的臨床試驗中發現，阿那白滯素亦具有改善冠狀動脈及左心室功能的作用[42]。靶向IL-1β的人單克隆抗體卡納單抗可阻斷炎癥通路，抵抗心肌細胞炎癥壞死。2017歐洲心臟病學學會年會上公布了卡納單抗最新Ⅲ期大型臨床試驗——卡納單抗抗炎性血栓轉歸的研究結果，該結果顯示，卡納單抗靶向作用于IL-1β/IL-6通路可顯著降低炎癥性心血管不良事件發生的風險[43-44]。在大鼠MIRI模型的研究中也發現，降低循環中的IL-18水平同樣可延緩炎癥和損傷進展，提升心臟功能[45]。可見，IL-1、IL-18是MIRI心肌損傷重要的介導因素，拮抗IL-1和IL-18受體、干預上游重要激活物NLRP3炎癥小體的功能對MIRI有保護效應，是防治MIRI靶向藥物研發的新方向，值得進一步探究。

長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)也參與了MIRI的病理過程。lncRNA可通過調節相關微RNA(microRNA，miRNA)的表達，調控NLRP3炎癥小體和心肌細胞焦亡，有可能成為MIRI臨床診斷標志物及分子類藥物靶點。研究發現，lncRNA-肺腺癌轉移相關轉錄子1在MIRI中高表達，可通過“海綿吸附效應”降低miR-133水平，促進缺血再灌注心肌中NLRP3炎癥小體的表達，加重炎癥反應和再灌注心肌損傷[46]。Zhao等[47]研究發現，下調lncRNA-肺腺癌轉移相關轉錄子1、上調miR-145可減少MIRI模型小鼠心肌損傷和細胞凋亡，發揮心臟保護作用。miRNA是NLRP3炎癥小體重要的調節劑，亦是MIRI重要的調控因子之一。在MIRI動物模型實驗中發現，miR-223、miR-495、miR-135b等可以靶向下調NLRP3及其下游因子的表達水平，抑制缺血再灌注誘導的心肌細胞毒性和細胞焦亡，改善炎癥反應，恢復受損的心臟功能[48-50]。目前對lncRNA的認識還較膚淺，相信隨著科技的發展，未來能夠發掘更多特異性調控NLRP3炎癥小體和細胞焦亡的lncRNA，并成功地應用于MIRI的臨床診治中。

此外，許多中草藥活性成分在防治MIRI方面也具有重要作用，具有潛在的臨床應用價值。中草藥成分木樨草素、燈盞花乙素、甲氧基異黃酮等已被證明可針對性地干預NLRP3炎癥小體的活化，具有對抗MIRI的效用[4,18,51]。臨床上，常用于治療心腦血管疾病的中成藥腦心通也被證明在MIRI模型中可通過抑制NLRP3炎癥小體的活化發揮心臟保護作用[52]。近年研究還發現，白芍總苷、大黃素、天麻素等均可有效改善MIRI心肌損傷，減小梗死面積，其作用機制可能與負向調節NLRP3炎癥小體觸發的心肌細胞焦亡有關[28,53-54]。傳統中醫藥具有多成分、多靶點、多通路的優勢，在心血管疾病(包括MIRI)臨床治療方面具有良好的療效。但由于中藥發揮作用的具體機制及不良反應目前尚不明確，其在臨床應用中仍存在局限。相信未來通過對中草藥分子、基因水平作用機制的深入探索以及循證科學證據的積累，可為中醫藥在MIRI防治中發揮重要醫學價值奠定基礎。

4 小 結

NLRP3炎癥小體的活化效應對MIRI發生、發展過程具有重要影響，阻斷NLRP3炎癥小體相關信號通路可有效發揮心肌保護作用，是研發防治MIRI新藥的一個重要分子機制。目前，靶向干預NLRP3炎癥小體及其下游分子治療MIRI的藥物研究層出不窮，其中中草藥的潛在價值凸顯，但僅限于基礎研究，尚未在臨床推廣應用。NLRP3炎癥小體在MIRI中具體的激活和調控機制目前尚未明確，因此，未來如果能在NLRP3炎癥小體的科研工作上取得重大進展，將有助于進一步明確NLRP3炎癥小體在MIRI中的作用及分子機制，為MIRI乃至其他心血管疾病的臨床防治提供新思路，同時也為研發新一代藥物提供新靶點。