miRNA研究向結直腸癌臨床轉化應用的現狀

李晨，杜曉輝

(解放軍總醫院普外科，北京 100853)

隨著社會生活方式多元化的改變，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)防控面臨著前所未有的挑戰，我國已將CRC納入精準扶貧專項救治九大病種之一。目前基因工程研究雖然在CRC診治方面取得了可喜的成績，但諸多研究仍停留在實驗室階段，即便涉及臨床應用的研究，細胞水平研究仍占多數，僅有少部分進入動物實驗階段，能夠用于臨床的非常有限。轉化醫學作為連接基礎研究和臨床治療的“橋梁”和以將醫學科學發現轉化為臨床實際運用為宗旨。我國的國家轉化醫學中心建設尚處于起步運作階段，但已成為落實健康中國國策和促進我國經濟社會發展創新驅動戰略的重要生力軍[1]。“以轉化醫學為核心”的醫學研究理念，正在引領國內醫療多學科臨床應用的不斷突破，通過不斷提升醫療技術，更好地惠及患者。將微RNA(microRNA，miRNA)實驗室研究成果轉化為臨床成果，并加速兩者之間的轉化，已成為業界共識。CRC缺少早期檢測手段，手術治療受到相關適應證的制約，且缺乏有效的術后復發及化療監控措施[2]，防控形勢嚴峻。現對目前miRNA在CRC早期篩查及CRC手術過程的臨床轉化應用現狀予以綜述。

1 miRNA在CRC早期篩查中的臨床轉化應用現狀

由于我國工業化、城市化進程的加快，我國常見癌癥譜同時表現出發達國家和發展中國家的雙重特征，其中CRC的變化尤為突出。CRC發病人數劇增，患者發病年齡結構與世界CRC發病年齡結構逐漸接近，由老年人群向青壯年人群轉變[3]；且男性發病居高不下。miRNA在CRC早期篩查中的臨床應用起步較早，其中CRC糞便、血液miRNA檢測已開始臨床應用，但組織miRNA檢測仍處于實驗室階段。miRNA作為CRC分子生物標志物，完成CRC早期篩查的miRNA臨床轉化并將其應用于臨床診治還面臨許多問題。

1.1糞便miRNA檢測CRC的現狀 糞便標本易采集，故糞便miRNA檢測在CRC早期篩查中的應用比較廣泛。miRNA具有高度穩定性，Lee等[4]發現，體液中miRNA對于核糖核酸酶(Rnases)的自我消化具有抵抗能力，且糞便樣本中miRNA也保持在一定的濃度。

miRNA在CRC篩查中具有一定優勢。Choi等[5]報道，早期CRC患者糞便中腫瘤細胞含量高，易被檢出。對糞便miRNA表達篩查CRC的敏感性及特異性的多變量分析顯示，miR-92a和miR-144與大腸癌的發生顯著相關，糞便miR-92a和miR-144檢測大腸癌的敏感性和特異性良好。研究顯示，miR-29a、miR-224、miR-17、miR-20a、miR-21、miR-92、miR-224均在糞便中高表達[6-7]。

糞便內環境復雜惡劣、經過漫長的通道和漫長的時間排出體外、人RNA占比偏小是miRNA檢測臨床應用的主要問題。糞便miRNA作為的CRC診斷標志物，需進一步優化標本采集、標本分離、標本提取和檢測技術等糞便miRNA檢測程序，從而大幅度提升標本的可測性、再現性[8]，以真正實現CRC糞便miRNA檢測從實驗室研究到臨床應用的轉化。

1.2血液miRNA檢測CRC的現狀 miRNA可以被分泌到細胞外，是細胞微環境和機體體液中的重要調控分子，在人體外周血中保持著一定濃度。研究發現，CRC患者血清中某些miRNA異常表達[9-11]。ElSharawy等[12]分析了血清miRNA攜帶顆粒的有效濃度是否可作為檢測生物標志物的基礎，結果發現，在742個miRNA標本中，其中45個CRC標本的全血清和顆粒濃縮血清存在顯著差異，提示通過檢測血清miRNA載體可以檢測CRC相關的病理變化。

目前臨床常用的癌胚抗原、糖類抗原(carbohydrate antigen,CA)19-9、CA125診斷結直腸癌的靈敏度僅為50%～65%[13]。CRC患者外周血中miRNA的生物學活性和穩定性良好，具有獲取方便、容易保存、不易降解等特點，且篩查CRC的特異性、敏感性較癌胚抗原、CA19-9、CA125等標志物更具優越性。

血液的稀釋效應對單位體積miRNA起始含量的影響限制了血液miRNA檢測CRC的臨床應用，導致血液miRNA檢測的準確性無法保證；細胞溶血及細胞碎屑可能直接降低檢測標本的敏感性。目前，仍需要大樣本多中心的CRC血液miRNA檢測的驗證，為臨床提供準確、安全、高效的檢測方法。

1.3組織miRNA檢測CRC的現狀 目前，CRC組織miRNA檢測以基礎研究為主，通過不同miRNA在CRC及癌旁正常組織的異常表達確定異常表達miRNA的目的靶基因，根據靶基因不同作用靶點，闡述CRC的調控機制。雙熒光素酶報告基因檢測法是目前應用最廣泛的miRNA靶基因結合位點鑒定方法，相關研究通過熒光素酶報告基因分析證實了不同miRNA靶基因的結合位點，miR-143靶向作用于結腸癌轉移相關基因1的3′非翻譯區；miR-152通過靶向磷脂酰肌醇-3-激酶在CRC中發揮抑癌作用；miR-150靶向作用于p53凋亡刺激蛋白家族抑制性成員的3′非翻譯區；miR-382可以靶向作用于核受體家族成員2的3′非翻譯區[14-17]。

不同miRNA靶基因的確定為揭示CRC的發病機制奠定了基礎。不同miRNA在CRC發病過程中的作用不同。針對miRNA在CRC發病的不同節點、不同環境、不同條件、不同特征，挖掘并制訂相關診療措施成為可能。目前，針對CRC組織的miRNA檢測較廣泛，涉及數百種miRNA，以基礎研究為主，基礎研究對發病機制的揭示是實驗室科研成果應用于臨床的基礎及關鍵。

CRC患者糞便、血液、組織分子標志物檢測的應用率僅為20%～30%，其在健康篩查中的應用率更低。價格昂貴、檢測技術不成熟、檢測標準不統一、檢測流程不規范、檢測周期較長均是影響糞便、血液、組織分子標志物檢測臨床推廣應用的主要原因。此外，臨床工作者對CRC的miRNA檢測認知度差、執行力不足等亦制約了CRC糞便、血液、組織中分子標志物檢測的臨床應用，進一步加強CRC檢測技術臨床轉化的研究，使實驗研究盡可能地滿足臨床需要并臨床應用于臨床實踐，將有利于提高CRC的檢測率和檢測質量，大大提高CRC的早期診治效率。

2 miRNA在CRC手術過程中的臨床轉化應用現狀

目前手術治療仍是CRC首選的最重要、最有效的治療方式之一[18]。為提升手術質量，學者們嘗試將miRNA檢測轉化應用于CRC手術全過程，包括術前手術適應證的選擇、術中觀察手術前后miRNA的變化、術后復發及化療敏感性的監測。

2.1miRNA檢測在CRC術前的應用 手術適應證的選擇是確保手術治療成功的基礎，目前CRC的手術適應證仍以美國腫瘤聯合會制訂的癌癥TNM分期為基本依據。TNM分期既是臨床判斷CRC病情嚴重程度的重要標準，也是制訂CRC診療策略的基本指南[19]。miRNA在CRC患者術前檢測的應用，對CRC手術治療較局限，僅對臨床早、中期(即TNM分期Ⅰ、Ⅱ期)CRC患者有效，對TNM分期Ⅲ、Ⅳ期的CRC效果極差，甚至無效。為解決這一難題，2016年新修訂的第8版癌癥分期系統引入了新的分子標志物[20]。

隨著對miRNA與TNM分期的關系的深入研究，Arabsorkhi等[21]研究發現，miR-298的異常水平與CRC腫瘤分化、TNM分期和淋巴結轉移有關。Hong等[22]報道，miR-497-5p表達水平低與CRC患者TNM分期高、淋巴結轉移顯著相關。Wang等[23]揭示miR-511-5p表達降低與組織學分化、侵襲和TNM分期呈負相關。Hu等[24]在探討miR-1229通過靶向同源結構域相互作用蛋白激酶2促進血管生成的機制研究中發現，exomiR-1229水平顯著升高，與腫瘤大小、淋巴轉移、TNM分期和生存不良顯著相關。

miRNA引入TNM分期系統，作為TNM分期的一種補充，極大提升了TNM分期的準確性、有效性及實用性[25]。根據CRC患者術前miRNA檢測水平，依據腫瘤侵襲程度，淋巴結轉移范圍和有無遠端臟器的轉移綜合評估TNM分期，使手術適應證的選擇更加準確、有效，有助于開展個體化治療，提高精準化治療水平。分子檢測手段從實驗研究進入臨床應用，標志著開啟了結直腸癌“分子診斷和治療”的新時代。

2.2miRNA在CRC術中檢測的應用 miRNA在CRC發生發展過程中呈現動態變化[26]，Maierthaler等[27]比較了miR-122對非轉移性與轉移性CRC預后的影響，轉移性CRC無復發率和總生存期以及轉移發生率均高于非轉移者。新近研究發現，CRC患者miR-221-3p及miR-133a-3p過表達時，患者生存期較短[28]。

miRNA在病程不同階段的特征性演變特征，引發了學者們對CRC患者手術前后miRNA變化的關注。Ogata-Kawata等[29]通過對比CRC患者與健康人群血清16種外泌體來源的miRNA，結果發現其中7種miRNA(miR-21、let-7a、miR-23a、miR-1229、miR-150,miR-1246,miR-223)的含量在CRC患者血清中顯著升高，且均在經過手術治療后，表達水平明顯下降。Wu等[30]證實，結直腸癌和高級別瘤變腺瘤患者術前糞便脫落細胞中miR-135b的表達較健康人群升高，術后表達量下降明顯，認為miR-135b可作為檢測CRC和晚期腺瘤的生物學標志物，并能檢測手術治療效果。Fang等[31]研究發現，與健康對照組相比，CRC患者術前血漿miR-24、miR-320a和miR-423-5p表達水平明顯降低，而術后臨床好轉CRC患者血漿miR-24、miR-320a和miR-423-5p表達水平明顯升高。因此，CRC患者手術前后miRNA的動態變化，可作為判斷手術效果的間接證據，可能對提升手術質量有一定的積極意義。

2.3miRNA在CRC術后檢測的應用 CRC患者術后面臨兩大問題，即患者術后復發的檢測和術后化療的選擇。通常術后復發與轉移是CRC患者死亡的最重要原因。據統計，CRC術后患者的轉移率高達50%[32]。對于手術治療CRC患者，有效監測術后病情變化并及時發現復發轉移傾向可為早期進行臨床干預提供依據[33]。目前，術后復發多依賴組織病理學檢查確診，由于病理標本的獲取受到多種因素的影響，常規病理檢查發現術后復發具有一定的局限性。近年來，應用miRNA檢測預測手術復發，引發了大家的關注。有報道稱，miR-21與miR-92聯合檢測預測術后CRC復發的靈敏度為80.6%，特異度為95.3%[34]。

手術后聯合化療作為中晚期CRC的主要治療方法，現廣泛應用于臨床。常用化療藥物的多藥耐受性是CRC治療面臨的主要障礙之一。面對CRC對化療藥物治療應答差的難題，學者們針對miRNA在蛋白轉運、凋亡蛋白及細胞周期調控等重要環節做了大量研究。Li等[35]研究miRNA通過轉運蛋白對化療敏感性影響發現，miR-34a能抑制ABC轉運蛋白泵出細胞內過量藥物，從而提高化療效果及化療敏感性。Liu等[36]認為，miR-15可能通過調控凋亡蛋白影響化療患者對5-氟尿嘧啶或奧沙利鉑誘導的細胞凋亡水平，增加藥物的敏感性。Xu等[37]研究發現，miR-503-5p可通過促凋亡蛋白p53上調凋亡調控因子調控CRC的耐藥性。研究表明，miR-139-5p有誘導CRC細胞在G0/G1或S期阻滯的作用，在miR-139-5p轉染細胞化療后，對化療制劑具有更高的敏感性[38-39]。Ye等[40]應用化療藥物5-氟尿嘧啶常規化療方案發現，miR-141能增強化療后的腫瘤細胞藥物敏感性，其機制可能通過靶向細胞周期蛋白D2發揮作用。

miRNA對化療敏感性調控，還包括對壞死蛋白調控、基因轉錄過程調控、DNA損傷修復等環節。目前，關于miRNA預測CRC患者預后和評估化療藥物反應的研究較多，但存在一些問題，如miRNA特征不重疊，所得實驗結果可重復性差，且相關報道的研究結果存在矛盾。因此，CRC藥物治療應答差的問題急需解決。

3 miRNA在CRC臨床轉化應用中的難點及研究熱點

近年來，腫瘤診治相關基因工程取得了巨大進展[41]，國內研究者通過對miRNA癌癥協會數據庫提供的可檢索分析的PubMed數據庫建庫至2017年3月所有關于人CRC中miRNA的近400多篇文獻進行分析發現，涉及診斷的miRNA研究約占18/160，涉及治療的miRNA研究約占15/160，涉及預后的miRNA研究約占41/160，涉及增殖及轉移的miRNA研究約占60/160，其中有部分是重疊使用相互交叉的研究，以處于細胞水平且涉及臨床應用的研究占多數，僅有少部分研究進入動物實驗階段，能夠應用于臨床的研究非常有限[42]。可見，真正實現miRNA與CRC之間的臨床應用轉化仍任重道遠。

由于miRNA分布廣泛、作用靶點多樣、調控方式復雜，不同種類miRNA功能之間存在重疊性、相似性。目前，同一種miRNA對不同腫瘤的作用存在不一致性、不均一性或截然相反的作用，其內在規律還未被充分認識和掌握，是基礎研究向臨床應用研究發展的重要難點，成為轉化應用研究的研究熱點[43]。

3.1miRNA基因表達多態性及調控復雜性對CRC臨床轉化應用的影響 人類健康的需求是推動科技發展以及促進miRNA研究向CRC臨床轉化應用的巨大動力。為攻克基因表達的多態性及調控的復雜性的影響，眾多科研人員付出了長期艱辛的勞動。

癌癥基因組圖譜[44]運用生物技術、信息技術等一系列分子研究技術和醫學前沿實驗研究技術，進行生物標志物的分析與鑒定、驗證與應用，為miRNA研究的CRC臨床轉化應用、診治及精準醫療和個性化靶向治療提供了基礎條件。個性化靶向治療是miRNA基礎研究的突破口，也是最受臨床期待的一種治療方法[45]。為成功實現CRC臨床轉化，首先要重視基因表達多態性及基因調控網絡復雜性的研究。

miRNA作為CRC的輔助治療，具有廣闊的應用前景。臨床miRNA模擬物的開發[46]以及miRNA拮抗劑的研制[47]成為miRNA應用臨床的主要方式。RNAi干擾技術是驗證miRNA通過調整相關基因起作用的可靠技術，隨著該技術的成熟，miRNA模擬物及其拮抗劑逐漸應用，可能成為抗腫瘤轉移治療潛在的治療靶點[48]。

miRNA模擬物可通過化學方法合成，在鑒定與確認miRNA靶標時發揮主要作用。miRNA模擬物制作過程簡單，不需要構建載體，轉入的細胞量可控、可調整，常用作臨床腫瘤治療劑。早在2015年，miRNA模擬物的臨床開發已出現。利用納米技術加工處理miR-150并制成藥物制劑，采用介入療法將其緩慢置入體內腫瘤細胞，以緩慢提升細胞內miR-150水平，發揮類似miR-150的生物學效應，從而更大限度地發揮miR-150在腫瘤發生發展過程中的抑癌作用，開創了miRNA模擬物臨床應用的先河[49]。

miRNA拮抗劑通過阻止miRNA與相應靶基因的互補配對抑制miRNA作用，其優勢是穩定性高、抑制效果強于普通抑制劑、給藥方式靈活且方便。導入特定miRNA拮抗劑或與miRNA前體的發夾或莖環部分結合，使其不能被Dicer加工生成成熟的miRNA，亦可與miRNA上oncomiRNA結合序列結合，進而抑制后者和特定靶miRNA結合，從而保護靶miRNA。miRNA拮抗劑可逆轉具有促癌作用的基因功能，發揮抑癌效應。Chen等[50]報道，應用miR-451拮抗劑可有效抑制CRC的遷移和增殖。

miRNA作為新型特異性分子靶標，參與了腫瘤診斷、治療的過程，現已明確的與腫瘤相關的miRNA有千余種，但仍缺乏對其系統、全面、多方位的認知與了解。進一步加強對基因表達多態性以及對基因調控網絡復雜性的深刻認識是miRNA基礎研究向CRC臨床轉化的重點。

3.2miRNA目的基因安全性及質粒載體穩定性對CRC臨床轉化應用的制約 目前，目的基因載體構建(vector construction)技術[51-52]在miRNA臨床轉化研究中應用最廣泛。含外源DNA質粒的構建是載體構建的核心技術。質粒作為運載體，實質上是一種運輸工具，負責將DNA分子運送到受體細胞，并使裝載外來DNA片段的受體細胞繼續履行復制功能。在人工質粒構建過程中，為了確保質粒的安全性、穩定性、便捷性，科研人員做了大量的嘗試與努力。

傳統載體構建多用腺病毒和慢病毒，病毒載體轉染效率高，但由于病毒本身的生物學特性，存在致病性、復發性、不確定性、不可控性以及難以大量制備等缺點，限制了其臨床應用。同時，由于缺乏相關載體動物模型，影響了其臨床應用。

使用非病毒載體進行質粒構建已成為當前miRNA臨床轉化研究的首選[53]。近年來非病毒載體的研制與開發為人工載體構建開辟新的視野。使用非病毒載體有助于解決腺病毒和慢病毒載體的種種弊端。有研究者已成功采用脂質納米粒子，并將miR-21包裝為成熟的miRNA，以此為載體運送至腫瘤組織、腫瘤細胞及全身各系統[54]。非病毒載體的研制(在品種、有效性、準確性方面)真正應用于臨床腫瘤治療，仍需要一個漫長的過程。

3.3miRNA檢測技術限制了CRC臨床轉化應用 在基因治療中，實驗技術往往決定了研究的成敗。實驗技術的成熟和進步，使基礎理論研究向臨床轉化成為可能，能夠促進實驗室前期研究向臨床治療后期研究的銜接和過渡。目前，miRNA檢測技術尚不完善、不成熟，限制了其臨床轉化應用。

miRNA檢測的常用方法包括經典印跡雜交(Northern blot)、微陣列芯片(Microarray)、實時熒光定量聚合酶鏈反應以及測序法，它們都存在檢測過程繁瑣、費時、敏感性低、操作難、重復性差、成本高、不穩定等缺點。滾環擴增是目前較成熟的miRNA擴增技術，其優勢在于可在短時間內使miRNA分子數量倍增，使檢測信號放大，以更多地應用于臨床監測；熒光原位雜交技術結合滾環擴增可在短時間內實現細胞內miRNA的定位以及定量分析，對研究細胞內miRNA的功能及相關疾病發生的分子機制有重要意義；而基于特異性酶輔助檢測以及納米孔檢測等技術，可明顯增強熒光信號的優點，提升檢測的敏感性[55-57]。Duan等[58]利用信號放大機制運用等溫擴增體系處理核酸外切酶和切口酶，有效解決了目標靶基因觸發及寡核苷酸單鏈合成工程中的靈敏度檢測問題，大大提高了miRNA檢測技術的敏感性。

近年來，對于提高miRNA檢測技術臨床應用可重復性及可操作性的研究較多，如系統檢測實施同一患者糞便、循環、癌組織；在正常人、CRC癌前病變患者及不同階段CRC患者中建立系統完善的miRNA差異表達譜，將有助于建立一套完善的、符合國人體征、適合中國國情的CRC篩查體制和臨床診治機制。

4 小 結

在現代醫學科學由“循證醫學”“轉化醫學”向“精準醫學”的重要轉變過程中，“轉化醫學”起著承上啟下的作用。基于CRC臨床診治的miRNA研究是成功實現轉化的基礎；準確選擇miRNA向CRC臨床轉化應用的路徑是成功實現轉化的關鍵；克服miRNA在CRC臨床應用中的難點是成功實現其臨床轉化的標志。目前miRNA臨床轉化研究亟待解決的主要問題包括關鍵技術、關鍵環節、突出問題(如DNA測序技術開發、外泌體介導的miRNA研制)，此外應加快miRNA激活劑及抑制劑的研制，開發更多、更安全的非病毒載體，以盡快解決miRNA分子治療中輸送途徑的安全問題。未來miRNA在CRC臨床轉化應用中將發揮重要的作用。