黑果小檗總花色苷對帕金森大鼠認知行為能力、神經保護及Klotho基因表達的研究

李文杰，羅遠，劉婷，姚麒

帕金森病（PD）主要病理改變為多巴胺能神經元缺失，屬于中樞神經系統退行性疾病，而PD患者最常見的非運動癥狀就是認知功能障礙（CI）[1]。黑果小檗是一種落葉灌木植物，資源豐富，具有強胃、生津止渴、清熱解毒的功效[2]。有研究發現，黑果小檗果實中花色苷具有增強抗氧化防御系統，提高老齡動物的記憶力，調節膽堿能神經傳遞等治療神經退行性疾病的作用[3]。Klotho是一種衰老抑制基因，Kl蛋白功能下降會導致多巴胺能神經元的數量下降，抑制多巴胺的合成，PI3K-PKB磷酸化激活轉錄調節因子FoxO，進而參與神經元細胞凋亡、衰老及代謝[4]。本研究探究黑果小檗總花色苷（BHSTA）對帕金森大鼠的認知行為能力、神經保護及Klotho基因表達的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 80只SPF級雄性大鼠，體質量220～250 g，8周齡，均置于溫度為22～25℃，濕度為40%～50%的動物房內統一飼養。

1.2 藥材 黑果小檗源于烏魯木齊市南山山區，經鑒定為小檗科小檗屬植物黑果小檗的果實，提純后得到BTA凍干粉末（含量為39%）。

1.3 試劑 鹽酸阿撲嗎啡，6-羥基多巴（6-OHDA），多聚甲醛，中性樹脂，Klotho抗體、Foxo3a及P-Foxo 3a抗體。

1.4 PD大鼠模型制備 80只大鼠隨機分為假手術組15只，模型組65只，將65只大鼠參照文獻[5]中雙靶點注射法制備PD-CI大鼠模型。水合氯醛麻醉大鼠并固定，大鼠的頭部用腦立體定位儀固定，在黑質致密部和中腦腹側被蓋區，15 min內用微量注射器注入4 g/l的6-OHDA。7 d后，大鼠均腹腔注射0.5mg/kg鹽酸阿撲嗎啡，誘導大鼠的旋轉行為，并記錄注射后30 min內的旋轉次數。模型制備成功標準：旋轉次數≥7次/min。在制成PD大鼠模型過程中有5只大鼠死亡，剩下60只大鼠均制備成功。假手術組大鼠注射等量含0.2 g/L抗壞血酸的0.9%氯化鈉注射液，手術方法同模型組。

1.5 大鼠分組及給藥 將造模成功的60只大鼠隨機分為模型組（予0.9%氯化鈉注射液灌胃）、低劑量組（予54.6mg/kg BHSTA灌胃）、中劑量組（予109.3 mg/kg BHSTA灌胃）和高劑量組（予218.6 mg/kg BHSTA灌胃），各15只。假手術組大鼠給予等量的0.9%氯化鈉注射液灌胃干預。1次/d，連續給藥28d。

1.6 神經行為學檢測 觀察大鼠行為改變，行旋轉誘導實驗，記錄30min內大鼠旋轉圈數，并計算其平均旋轉圈數。

懸掛實驗：將大鼠前肢懸掛于離地面30 cm高的金屬絲上，記錄從開始懸掛至落地時的時間并評分。評分標準：持續0～5 s記為0分，6～10 s記為1分；11～15s記為2分，16～20s記為3分，21～25 s記為4分，26～30 s記為5分，超過30 s記為6分，實驗3次，取平均值，每次實驗時間間隔約2 min。

1.7 Morris水迷宮實驗 將水池分為大小相同的4個象限，于3象限內的中間位置放置一個圓形的位于水面下2cm的黑色站臺，并在池壁內側做好不同形狀的標記。將攝像機置于迷宮的上方，記錄大鼠的運動軌跡。計算大鼠在平臺所有象限的距離百分比（PT%）和停留時間百分比（T%）。

1.8 樣本采集 行為學實驗結束后，取大鼠腦組織，分離獲得腦黑質，一部分用多聚甲醛固定，在4℃冰箱中保存備用；另一部分凍存于液氮中。

1.9 TUNEL染色檢測神經元凋亡 用多聚甲醛固定備用的腦黑質，24 h后石蠟包埋，切片，置于冰箱備用。取出切片，洗滌后封閉1 h。加入一抗在4℃的環境中孵育過夜；再次洗滌后加入帶有熒光標記的二抗，孵育1 h后洗滌，置于顯微鏡下觀察。

1.10 蛋白質印跡測定腦黑質中Klotho、Foxo3a、p-Foxo3a蛋白表達 取液氮凍存的腦黑質，研磨裂解后取蛋白樣本。取30g蛋白樣本煮沸、電泳、PVDF膜轉印，加入Klotho及p-Klotho一抗、Foxo3a及p-Foxo3a一抗、羊兔抗HRP標記二抗，蛋白質印跡法測定神經元內Klotho和p-Foxo3a蛋白表達，并測定蛋白的相對灰度值。

1.11 統計方法 采用SPSS 21.0統計軟件進行處理，計量資料用均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BHSTA對大鼠的神經保護功能 與假手術組相比，模型組大鼠旋轉圈數增多，懸掛實驗評分降低（均P＜0.05）；低、中和高劑量組大鼠的旋轉圈數少于模型組，懸掛實驗評分高于模型組（均P＜0.05）；高劑量組大鼠旋轉圈數低于低劑量組，懸掛實驗評分高于低劑量組（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠旋轉圈數和懸掛實驗評分比較

2.2 BHSTA對大鼠認知功能影響 與假手術組相比，模型組大鼠PT%、T%值降低（均P＜0.05）；低、中和高劑量組PT%、T%值均高于模型組（均P＜0.05）；高劑量組大鼠PT%、T%均高于低劑量組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠PT%、T%比較

2.3 BHSTA對神經細胞凋亡的影響 相對于假手術組，模型組大鼠腦組織中神經細胞凋亡明顯增多（均P＜0.05）；而與模型組相比，低、中和高劑量組神經細胞凋亡均降低（均P＜0.05），且凋亡程度呈濃度遞減趨勢，高劑量組神經細胞凋亡情況低于低劑量組（均P＜0.05），見封二彩圖1。

2.4 Klotho、Foxo3a、p-Foxo3a蛋白的表達情況 與假手術組相比，模型組Klotho和Foxo3a蛋白表達顯著降低，p-Foxo3a蛋白表達明顯升高（均P＜0.05）；與模型組相比，低、中和高劑量組Klotho和Foxo3a蛋白表達均不同程度的增加，p-Foxo3a蛋白表達均顯著降低（均P＜0.05），且高劑量組蛋白變化與低劑量組差異有統計學意義（均P＜0.05），見封二彩圖2。

3 討論

PD是一種椎體外系變性疾病，臨床常用手術干預或藥物替代治療，但手術創傷和藥物依賴會加重認知障礙的風險[6]。黑果小檗果實中的花色苷有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用，常用于治療亨廷頓病、局部缺血性腦卒中等疾病[7]，但關于BHSTA應用于PD的研究少有報道。本研究顯示模型組大鼠旋轉圈數增多，懸掛試驗評分降低；BHSTA干預后的低、中、高劑量組大鼠旋轉圈數減少，懸掛實驗評分升高。這提示BHSTA可改善PD大鼠的神經功能。水迷宮實驗結果顯示，BHSTA能增加PT%和T%值，增強PD大鼠的認知記憶能力。既往研究也證實，BHSTA可有效改善AD大鼠的CI和腦組織損傷[8]。

研究發現，PD患者臨床表現有腦萎縮，主要累及海馬、鉤回及后扣帶回等部位。PD-CI腦功能的退行性改變可能與海馬區神經元線粒體損傷、自由基調節失衡、能量代謝障礙或細胞衰老有關[9]。Klotho基因與衰老的調控關系密切，Klotho基因缺陷的大鼠通常會出現衰老等癥狀，通過增加Klotho基因表達，可抑制胰島素樣生長因子-1信號，進而延長大鼠的壽命，Klotho高表達可以抑制其下游Akt激活底物中的絲氨酸、蘇氨酸殘基磷酸化[10]。即Klotho減少會激活Akt通路，導致Foxo3a轉錄因子磷酸化和細胞中SOD表達減少，積聚MDA，進而對細胞中的蛋白質和DNA造成損傷，致細胞衰老。本研究結果顯示，模型組大鼠Klotho、Foxo3a表達顯著降低，p-Foxo3a表達升高。這說明PD大鼠神經元Foxo3a表達降低，使進入細胞核內的Foxo減少，引起細胞衰老；通過BHSTA干預使PD大鼠的Klotho、Foxo3a表達增加，減少PD大鼠的神經細胞衰老。王思夷等[11]研究證實，鹽酸多奈哌齊可能通過上調海馬區的Klotho表達，抑制Akt和Foxo3a磷酸化，提高血清SOD含量，進而提高PD大鼠的學習記憶能力。有研究表明黑豆提取物花色苷可提高老年大鼠學習能力，調控膽堿能神經傳遞及線粒體相關凋亡蛋白活性，從而降低神經元凋亡，對大鼠神經退行性病變、腦損傷等多種神經疾病均有一定改善作用[12]。

綜上所述，BHSTA可改善PD大鼠認知行為能力，保護大鼠的神經功能，其作用機制可能是通過調控Klotho、Foxo3a信號通路實現。