miR-141-5p在特發性少精子癥和無精子癥中的表達及臨床意義

王輝，周俊，馮奕

男性不育發病率近年來呈上升趨勢[1]。microRNA（miRNA）是一系列單鏈非蛋白編碼小RNA分子，在轉錄后水平調控基因表達，可游離于體液中[2]。血清、胸腹水等體液miRNA已顯示其作為疾病診斷生物標志的巨大潛能。同樣精漿miRNA在生殖疾病病因學研究方面和生殖遺傳研究領域也具有諸多優勢，精漿miR-141表達與精子的發生和形成有關[3]。本研究通過觀察miR-141-5p在特發性少精子癥和無精子癥中的表達，為臨床診治提供新的一種分子標志物，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 參照WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）標準，選擇特發性少精癥（精子濃度＜15×106/ml和精子總數＜39×106/一次射精）37例，年齡25～39歲，平均（32.1±4.4）歲；特發性無精癥（精液3 000 r/min離心15 min沉淀物中沒有精子）29例，年齡26～42歲，平均（31.5±6.7）歲。每例患者精液均常規分析3次以上，每次檢測間隔2個月；排除精液量異常、血精、液化不良、畸形精子癥、精液白細胞數≥1×106/ml以及高熱病史、自身免疫性疾病和接觸化學及放射性物質的相關職業者。另外選擇同期因女方不孕，男方生育能力評估正常的健康男性30例，設為正常對照組，年齡25～39歲，平均（30.2±5.4）歲。3組年齡結構、身體基礎等方面具有可比性，所有對象均簽署知情同意書并經醫院倫理委員會同意。

1.2 標本采集方法 依WHO要求，禁欲3～7d，排小便，并洗凈雙手和陰莖，再以0.1 mg/ml新潔爾滅對外尿道口消毒，手淫法收集全部精液于干燥消毒的精液釆集器內，置37℃多維混勻恒溫箱，待充分液化后行精液常規分析，3 000 r/min離心15min，取精漿1～2ml，置－80℃冰箱保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 精液常規質量參數分析 用北京偉力計算機輔助精子分析系統（CASA），在帶有加熱37℃載物臺的顯微鏡下用已預熱和已校正的高精度雙池網格精子計數板分析精子濃度和前向運動精子百分率，雙池檢測結果在95%CI內方可判定有效。精子存活率采用低滲膨脹實驗（HOS），精子形態采用改良Diff-Quick染色法，試劑由BASO公司生產并提供，各標本由不同的兩人平行測定2次，取平均值，兩次結果偏倚≥10%重新實驗。

1.3.2 精漿游離microRNA的提?。?）預處理，取200 l液化后精漿加入2 l 100 g/ml蛋白酶K（美國Sigma公司）于37℃水浴箱1 h后，再加入250 l 1×TRI-reagent buffer和0.018 g PEG20000（美國Sigma公司）充分混勻，于室溫下放置15min，然后12000r/min，4℃離心10 min，取上清液用于TRIzol法提取RNA。（2）TRIzol法提取RNA，取200 l預處理的精漿加入0.75ml TRIzol（美國Invitrogen公司）中充分均勻，將勻漿液倒入1.5 ml離心管中，再依次加入氯仿、異丙醇及95%乙醇，獲得總RNA。（3）提取效率評估，取2 l RNA溶液，加98 l水，混勻后經DU800紫外分光光度計（美國Beckman公司）測定A260/A280比值，1.8～2.0提示無DNA及蛋白質污染。

1.3.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應RTPCR（1）cDNA的合成：按照TaqManReverse Transcription Buffer 1.50 l，RNase Inhibitor 20 U/l 0.19 l，Nucleasefreewater4.16 l。15 l逆轉錄反應體系：RT master mix 7 l，total RNA 5 l，RT primer 3 l。逆轉錄反應條件：16℃30 min；42℃30 min；85℃5 min；4℃。（2）miR-141-5p及內參U6 snRNA擴增：根據TaqMan MicroRNA Assays（ABI公司）提供的引物及探針進行擴增，20 l PCR反應體系：TaqMan Universal PCR Master Mix II 10.00 l，Nuclease-free water 7.67 l，TaqMan Small RNA Assay（20×）1 l，ProductfromRTreaction1.33 l。PCR反應條件：50℃2min；95℃10min；95℃15 s；60℃60 s；40次，儀器用美國Stratagene公司Mx3000P型實時熒光定量PCR儀。

1.3.4 結果計算 精漿miR-141-5p表達量采用相對定量2-Ct方法Ct=CTmiR-141-5p－CTU6snRNACt=Ct不育患者－Ct正常對照。

1.4 統計方法 采用SPSS17.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用 檢驗，多組比較采用方差分析，多重比較采用LSD法；診斷效能分析采用受試者操作特征（ROC）曲線。＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組精液常規主要質量參數比較各組精子濃度差異有統計學意義（＜0.05），其他各質量參數差異均無統計學意義（均＞0.05），見表1。

表1 各組精液常規主要質量參數比較

2.2 各組精漿miR-141-5p的表達 各組精漿miR-141-5p的表達差異有統計學意義（=12.224＜0.05）。與正常對照相比，特發性少精癥和特發性無精癥精漿miR-141-5p表達顯著增高（=4.628、4.767，均＜0.05），特發性無精癥與特發性少精子癥間差異有統計學意義（=2.213＜0.05），見封三彩圖3。

2.3 精漿miR-141-5p對特發性少精癥和特發性無精癥的臨床價值miR-141-5p診斷特發性無精癥曲線下面積為0.920（95%0.855～0.984），當選擇最佳臨界值4.93時，其診斷敏感性為93.1%，特異性為76.7%。miR-141-5p診斷特發性少精癥曲線下面積為0.879（95%0.809～0.948），當選擇最佳臨界值5.36時，其診斷敏感性為96.3%，特異性為72.9%。見封三彩圖4～5。

3 討論

不育癥與心血管疾病、腫瘤已成為21世紀三大健康問題[4]。在我國，有15%～20%的育齡夫婦不能生育，男性因素約占50%[5]。男性不育致病原因復雜，開展的相關研究特別是微觀領域的研究尚很缺乏。近年來，世界各地科研工作者和臨床醫生已在分子領域對男性不育癥進行探索并取得了一定進展。

microRNA廣泛存在于人類的血液、尿液、唾液、痰液、精液、胸腹水、羊水及乳汁等體液中，在疾病的診斷和預后方面已經顯示了其獨特的應用價值。miRNA在精液中也非常的豐富，并且穩定存在[6-7]，前期研究也表明，一些miRNA分子在男性不育中有相當的臨床價值[8-9]。有研究發現，Dicer酶缺陷的老鼠，其生精小管內含有的圓形精子細胞數量較少，甚至還有一些異常的延伸精子細胞，延伸精子細胞通常表現出形態畸形和運動力低下等特點，這些因素均可以增加不育癥的發生率，因此miRNA可以作為一個關鍵因素決定生殖細胞的數量及功能。miR-141是miR-200家族成員之一，主要參與上皮-間充質轉化（EMT）、增殖、遷移、侵襲及耐藥等多種細胞過程。miR-141-5p屬于miR-141-5基因家族一員，參與細胞周期、凋亡的調控，與精子的發生、凋亡關系密切[10]。本研究發現特發性少精癥、特發性無精癥患者精漿miR-141-5p表達上調，與對照組相比有顯著性差異。miR-141-5p對特發性少精子癥和特發性無精癥均有很好的診斷價值分別為0.879（95%0.809～0.948），0.920（95%0.855～0.984），并且兩者敏感性和特異性均較高。這提示miR-141-5p功能表達與精子的發生和形成有關，可作為診斷特發性少精癥和特發性無精癥較好的分子標志物。