牙齦卟啉單胞菌與ESCC研究進展

劉書培，張秀森，李婉瑩，趙 迪，楊 澤，張旭東，原 翔

人體內大約有30萬億個細菌[1]。自從人類微生物組項目完成以來[2]，對微生物在人類健康中所起的作用越來越感興趣，許多研究已經將微生物群落的變化與全身狀況聯系起來，如動脈粥樣硬化、炎癥性腸病、過敏和糖尿病[3-5]。在受微生物群影響的全身疾病中，癌癥也不例外。很多腫瘤患者體內微生物群的變異和腫瘤組織內的異常微生物已被確定為腫瘤發生的關鍵標志物。口腔微生物組可以影響食管微生物組，從而可能促進ESCC的發生[6-7]。這一概念為微生物群和ESCC發展之間的關系增加了另一層復雜性。ESCC是胃腸道侵襲性最強的腫瘤之一，發病率也在逐年上升[8]。既往研究報道唾液中P.gingivalis的數量與口腔癌和ESCC的進展有關。在ESCC組織中P.gingivalis增多，并且這種感染與ESCC患者較短的生存時間密切相關。此外，較高的血清抗P.gingivalis抗體水平對ESCC的診斷和預后也具有重要意義。所有這些均支持P.gingivalis是ESCC的關鍵因素之一，并可能對ESCC的發生、進展和治療反應產生影響[9]。

ESCC是發展中國家食管癌的主要組織學亞型，在中國是癌癥相關死亡的第四大原因[8]。ESCC死亡率高，主要因為大多數病例在最初診斷時已經到了疾病終末期，盡管有多種治療手段，ESCC患者的5 a總生存率也僅為10%[8]。因此，尋求預防、早期發現和靶向治療的新方法至關重要。本文就近年來P.gingivalis與ESCC相關性及其發病機制進行綜述。

1 毒力因子

P.gingivalis是一種革蘭氏陰性專性厭氧桿菌，可表達多種毒力因子，包括菌毛、牙齦蛋白酶、血凝素、外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等[10]，主要的致病機制為造成免疫防御失調[11]。P.gingivalis是一種胞內致病菌，可侵襲多種真核細胞，改變其表達，規避宿主的免疫防御，造成再次感染。此外，它還能與宿主相互作用并在組織中定植。P.gingivalis可調節宿主的免疫反應，促進微生物生物膜的增殖，從而破壞宿主的穩態[11]。

為了有效定植，P.gingivalis分泌蛋白黏附素、血凝素和蛋白酶。P.gingivalis OMVs在CTD (C-terminal domain-family)蛋白中表現出豐富的選擇性，支持細菌內聚，促進生物膜的發育，并作為轉運細菌的中間體[12]。精氨酸特異性蛋白酶(Arg-specific gingipain,Rgp)和賴氨酸特異性蛋白酶(Lys-specific gingipain,Kgp)是半胱氨酸蛋白酶，屬于細胞外蛋白酶，對先天性和適應性免疫應答均有多種作用。這些半胱氨酸蛋白酶能夠廣泛降解結締組織和宿主防御分子。Rgp和Kgp被證明通過激活激肽級聯和補體C3和C5蛋白的液相轉化，與炎癥緩解和宿主防御高度相關。除了這些防御，一些其他因素，如菌毛、血凝素、脂多糖、鞭毛和主要外膜蛋白，也被證明具有潛在的毒性[13]。

2 肽基精氨酸脫亞胺酶和蛋白質瓜氨酸化在癌癥發病中的潛在作用

P.gingivalis是目前已知的唯一產生肽基精氨酸脫亞胺酶(peptidyl-arginine deimi-nase，PAD)的病原體。這種酶通過脫去蛋白質和肽中的精氨酸殘基來修飾細菌和宿主蛋白質，將它們轉化為瓜氨酸[14-16]。蛋白質瓜氨酸化通過改變蛋白質原有三維結構和功能的空間排列來解除對宿主炎癥信號網絡的調控[17]。宿主的內源性瓜氨酸來自5種鈣依賴酶，稱為肽基精氨酸脫亞胺酶(PAD 1，2，3，4/5和6)，這些酶與PAD非常相似，但又不完全相同[18-20]。宿主PADs與多種人類和動物癌癥有關。使用泛PAD抑制劑氯脒(Clam)抑制細胞骨架肌動蛋白的脫氨基作用，可以抑制腫瘤進展和炎癥癥狀[21]。

3 P.gingivalis通過激活NF-kB信號通路來促進ESCC

細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和C-Myc是G1-S轉變的關鍵調節器[22]。Western印跡和RT-PCR分析表明，在P.gingivalis刺激后，Cyclin D1和C-Myc的表達上調。在P.gingivalis刺激后，核中NF-kB(P65)的表達也上調[23]。Cyclin D1和C-MYC是NF-kB途徑的下游靶標[24]。另外，MMP2和BCL-XL的表達在蛋白質和mRNA水平上也上調。熒光素酶測定結果表明，ECA109和KYSE510細胞P.gingivalis刺激中，NF-kB的活性增加。相反，對照組中NF-kB的活性降低。這些表明，P.gingivalis發揮了至關重要的作用，并且可能是ESCC進展中NF-kB激活的重要刺激。NF-kB信號通路在調節對感染的免疫應答方面發揮著關鍵作用，并且該途徑與ESCC發展有關[23,25]。總的來說，這些研究表明，P.gingivalis誘導的ESCC細胞的增殖遷移可能與NF-kB信號傳導的激活有關，因此可作為ESCC的治療干預的目標[23,26]。

4 P.gingivalis通過TGF-β依賴的Smad/YAP/TAZ信號促進ESCC的進展

P.gingivalis的內化通過轉化生長因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)依賴的 Smads/YAP/TAZ (Yes-associated protein YAP65 homolog/Transcriptional coactivator with pdz binding motif)的激活，增強ESCC的侵襲和轉移，從而誘導上皮間充質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)[27]。P.gingivalis細胞內定植誘導的糖蛋白A重復序列(Glycoprotein-A repetitions predominant，GARP)上調加速TGFβ生物活性，推動ESCC進展和轉移。其中，P.gingivalis還能誘導細胞周期抑制劑和凋亡相關基因的上調，表明TGFβ信號通路是一個中介。值得注意的是，與野生型P.gingivalis相比，fimbrillin A (fimA)缺乏的P.gingivalis表現出增殖能力、遷移能力、侵襲能力和細胞內侵襲能力以及Smad2/3磷酸化能力的下降[28]。提示FimA通過TGFβ/Smad信號通路部分參與P.gingivalis的腫瘤促進作用。值得注意的是，ESCC中牙齦鏈球菌的數量與GARP、pSmad2、YAP/TAZ、Snail、TGFβ1和Oct4蛋白水平呈正相關[29]。此外，GARP與pSmad2、pSmad2與YAP/TAZ、YAP/TAZ與Oct4均存在顯著相關[30]。有證據表明，Hippo通路的效應子YAP/TAZ通過與Smads復合物結合，響應TGFβ來控制TGFβ/Smad信號通路[31]。此外，YAP/TAZ在ESCC中的致癌作用是必需的，因為YAP/TAZ缺失或YAP S94A/TAZ S51A突變體的過表達消除了P.gingivalis誘導的遷移、侵襲和轉移。這些數據表明，P.gingivalis刺激的YAP/TAZ活性是TGFβ/Smads信號通路介導的P.gingivalis.腫瘤促進功能的必要前提，而YAP/TAZ核積累可以消除這一功能。總之，基于P.gingivalis誘導的ESCC進展的復雜通路，其闡明了TGF-β規范信號級聯傳導[29]。

5 P.gingivalis通過修飾多種凋亡和細胞周期信號通路提高ESCC細胞的生存能力

胞內P.gingivalis感染后，通過短時間內增加PI3K/Akt信號通路，促進上皮細胞的存活和增殖，從而抑制細胞凋亡。此外，P.gingivalis通過分泌其效應蛋白核苷二磷酸激酶(Nucleoside diphosphate Kinase，NDK)，阻斷細胞外ATP/P2X7危險信號，保護自己和宿主上皮細胞免受線粒體和NOX2產生ROS的損害[32]。EMT是通過GSK3-β的失活而促進的[33]，GSK3-β通過增加Snail、Slug和β-catenin轉錄因子的表達和可用性促進E-cadherin向Vimentin的轉換[34]。β-catenin還上調cyclin、ZEB1和MMPs，導致上皮細胞增殖和遷移增加[35]。P.gingivalis通過其效應蛋白NDK直接磷酸化HSP27，從而繼續促進EMT，導致前MMP9水平的增加[36]。P.gingivalis增加了腫瘤干細胞標記物CD44和CD133的表達[37]。此外，P.gingivalis通過分泌細胞因子和趨化因子以及B7-H1和B7-DC受體的表達增加來調節免疫環境，導致活化的T細胞凋亡[38]。

信號傳導及轉錄激活因子 (signal transducer and activator of transcription,STAT3)對于P.gingivalis介導的口腔上皮細胞耐化學誘導凋亡和ESCC的可控進展具有關鍵作用。與對照組相比，P.gingivalis感染增強了紫杉醇處理的細胞中STAT3的表達，但降低了caspase-3的表達。提示STAT3和caspase-3的差異調控是P.gingivalis蛋白誘導ESCC細胞抗凋亡的關鍵信號通路[28]。此外，WP1066對STAT3的化學抑制可導致細胞凋亡，并消除P.gingivalis對紫杉醇誘導的細胞凋亡抗性的影響[39]。此外，抑制STAT3使P.gingivalis蛋白在紫杉醇處理的細胞中減少caspase-3，表明STAT3和caspase-3之間可能存在連接。證明STAT3和caspase-3信號是P.gingivalis誘導的抗凋亡信號的重要組成部分[40-41]。P.gingivalis刺激顯著增強了Cyclin D3和E1的表達。此外，P.gingivalis感染增強了KYSE30細胞中Thr 160處CDK2的磷酸化，這可以通過與cyclin蛋白結合增加活性并促進G1-S期轉變和S期進展，表明P.gingivalis可以利用細胞周期機制加速ESCC細胞的增殖[6]。

6 P.gingivalis的IgA或IgG水平和ESCC患者的預后關系

ESCC患者中抗P.gingivalis的血清中位IgA和IgG水平顯著高于食管炎患者和健康對照組。傳統的ESCC血清標志物如鱗狀上皮細胞癌抗原(SCCA)[42]、癌胚抗原(CEA)[43]、CYFRA21-1和糖類抗原CA199對ESCC的早期檢測和進展沒有足夠的敏感性和特異性[9]。其中IgA對早期ESCC的診斷效果明顯優于IgG (54.54% VS 20.45%)[9]。此外，血清中抗P.gingivalis的IgA或IgG水平高與ESCC患者的預后較差相關，特別是在0～Ⅱ期或陰性淋巴結轉移的患者。同時具有高IgA和IgG的患者預后最差。因此，結合IgA和IgG可以提高診斷，改善預后。P.gingivalis蛋白血清生物標志物對于早期檢測ESCC具有重要意義，并可能提高診斷和預后性能[9]。

7 P.gingivalis引起的癌變也有助于潛在致癌物的代謝

乙醛(ACH)是酒精的第一代謝物，是人類的第一類致癌物[44]。與口腔衛生良好的個體相比，口腔衛生不良的受試者體外唾液乙酰膽堿產生量高出2倍。P.gingivalis將乙醇轉化為乙醛，能夠誘導DNA損傷、誘變和上皮細胞的增殖。這可能部分地有助于解釋為什么酗酒和某些癌癥相關[6,45]。

近幾年來，微生物感染引起全身性疾病的發病率顯著上升，但疾病與發病機制的相關性尚不清楚。微生物、炎癥和宿主細胞代謝的調節都是致癌因素[46],但尚不清楚哪些因素起主導作用，以及它們之間存在怎樣的相互作用。P.gingivalis感染與ESCC發生發展相關，并與ESCC患者預后不良相關。此外，在體外和體內，P.gingivalis感染促進ESCC細胞生長，并使腫瘤細胞對化療誘導的凋亡產生抵抗。微生物可作為疾病診斷和監測的新的標志物。微生物在腫瘤發生過程中的特定靶點也可用于精確的靶向治療[47]。進一步探討P.gingivalis的發病機制，可以為癌癥防治提供新的方向，提高患者的健康水平和生活質量。