酶聯免疫吸附技術在飼料及食品安全檢測中的應用

史艷艷

（天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心 300402）

酶聯免疫吸附技術（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是基于抗原抗體反應的一種新型、快速的免疫測定技術。由于ELISA 檢測技術的靈敏度高、特異性強、選擇性好、實用性強，且不需要大型儀器設備，對工作人員的專業技能要求不高，被廣泛應用于分析化學、生物藥學、臨床醫學和食品安全等領域的檢測。ELISA 檢測技術不僅可以對飼料和食品中的藥物殘留、有害微生物和生物毒素等物質進行定性和定量分析，還能應用于轉基因食品的安全檢查，為飼料及食品安全提供參考依據。

1 酶聯免疫吸附技術概述

1.1 技術原理

ELISA 是基于抗原-抗體的特異性結合反應建立起來的一種快速檢測技術，即首先通過固相狀態的載體吸附已知的抗原或抗體，待測樣本中對應的抗體或抗原與之結合形成特異性的抗原抗體復合物，通過洗滌的方法區分固相載體上的抗原抗體復合物和其他物質，再加入酶標記的抗原或抗體，也會出現抗原和抗體特異性結合反應結合在固相載體上，加入酶反應的底物后，底物由酶催化為帶顏色的產物（顏色變化為定性檢測），通過吸光度值計算待測樣本的抗原（或抗體）量。由于產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，ELISA 還可以進行定量分析。

1.2 試驗類型

ELISA 檢測技術根據待檢物質類型和檢測條件主要分為間接法、競爭法和夾心法。間接法主要應用于抗體檢測，即將已知抗原和固相載體結合，加入待檢樣本，其特異性抗體和固相抗原結合形成固相抗原抗體復合物，洗滌后固相載體上只留下特異性抗體，再加入酶標抗抗體與其結合，間接對抗體標記上酶，加入酶的底物進行顯色即可。抗原程度的高低直接影響間接法的特異性。競爭法主要用于小分子抗原的檢測，即待檢樣本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合，若待檢樣本中的抗體含量多，其結合在固相上的酶標抗體會減少，因此，陰性反應顏色比陽性反應顏色更深更明顯。夾心法主要用于大分子抗原檢測，即通過固相抗體去檢測待檢樣本中的抗原，該方法更適合測定二價或二價以上的分子，可以形成兩位點夾心。

1.3 試驗優缺點

（1）優點：ELISA 檢測技術既可以檢測抗原，也可以檢測抗體，其反應特異性高、靈敏度強、試驗操作簡單、耗時短，不需要大型儀器設備，結果可讀性高，分析簡單且成本低，是當下較為理想的飼料和食品安全檢測技術之一。

（2）缺點：ELISA 檢測技術對試劑的選擇性高，對相對分子量小的化合物檢測難度大，且結構相似的化合物還會出現不同程度的交叉反應，因此，未來需要從單克隆抗體研發入手，加速不同檢測ELISA 試劑盒的開發，更好地普及和推廣ELISA檢測技術。

2 酶聯免疫吸附技術在飼料及食品安全檢測中的應用

2.1 農藥殘留的檢測

農藥殘留是威脅飼料和食品安全的重要因素之一，還會降低我國副產品的出口率，目前農業殘留種類主要包括有機磷、有機氯和擬除蟲菊酯類等，有機磷農藥殺蟲范圍廣，應用范圍大，對人畜的危害性較高，高效液相色譜法、氣相色譜法和薄層層析法檢測有機磷農藥殘留，樣品處理操作負責，而ELISA檢測技術。邢瑋瑋和陳燕敏（2018）通過ELISA 技術測定食品中有機磷農藥殘留，同時對比氣相色譜法和高效液相色譜法，結果發現ELISA 測定結果的可靠性更高，且操作更為方便[1]。

2.2 違禁藥物的檢測

鹽酸克倫特羅（CL）是一種腎上腺類神經興奮劑，CL 非獸藥也非飼料添加劑，常用于支氣管哮喘的治療；萊克多巴胺（RAC）是一種人工合成的克侖巴安β 腎上腺受體激動劑，常用于治療充血性心力衰竭癥。但CL 和RAC 人畜食用后會產生副作用，我國境內分別于2002 年9 月和2011 年12 月在飼料和飲用水中食用。但仍有部分養殖戶私用“瘦肉精”來抑制脂肪的合成，提高動物產品瘦肉率。賀健強等（2019）用ELISA試劑盒和液相色譜串聯質譜法（LC-MSMS）同時測定動物飼料中的CL 和RAC，結果發現，飼料樣品殘留量在0.1ug/kg 水平以上時，ELISA 檢測方法是一種快速篩查方法，且定性和定量結果可以作為初步快速篩查依據，而LC-MSMS 可用于精準定量[2]。

2.3 有害微生物的檢測

飼料中的有害微生物不僅會降低飼料品質，畜禽食用后還會擾亂腸胃微生物菌群，對畜禽是一種危害性較大的內源性污染，可直接威脅畜禽生命健康。沙門氏菌和大腸桿菌都是飼料中常見的有害微生物，飼喂時必須除去病原微生物污染的飼料，提高飼料安全性。韓志輝和張紅見（2011）通過Dot-ELISA 對西寧市某飼料廠飼料沙門氏菌進行檢測發現，Dot-ELISA 法與常規分離鑒定技術的符合率為82.23%，和常規分離鑒定技術相比，ELISA 檢測技術不僅縮短檢測時間，其較強的特異性和敏感性可以支撐ELISA 技術應用于飼料中沙門氏菌檢測[3]。

2.4 生物毒素的檢測

真菌是造成飼料毒素產生的關鍵，飼料中常見的生物毒素有黃曲霉毒素、玉米赤烯酮和霉菌毒素等。姚靜靜等（2019）首先制備了高靈敏度的AFB1 單克隆抗體，并通過ELISA 檢測方法對糧食和飼料中的黃曲霉毒素B1進行檢測，其AFB1 單克隆抗體的效價高達5.12×105，檢測范圍為0.014～1.920ng/ml，且與其他霉菌毒素無交叉反應，成功建立了靈敏度高和特異性強的AFB1 間接競爭ELISA 檢測方法[4]。張元杰（2018）通過ELISA 檢測技術測定臨沂市5 個縣區150 份煎餅類食品中黃曲霉毒素含量，結果發現，140 份樣本都檢出了黃曲霉毒素，其中102 份為黃曲霉毒素B1，含26 份黃曲霉毒素B1超標樣本[5]。

2.5 轉基因食品的檢測

轉基因食品是當下發展最快的新型食品，可以通過基因工程人為改變生物形狀、營養價值、產品品質和數量等，但轉基因食品的安全性、倫理學和環境污染情況也一直困擾廣大消費者的選擇，越來越多的國家采取強制性轉基因食品標識讓消費者享有知情權。轉基因食品檢測的常用方法有聚合酶鏈式反應、ELISA 檢測技術、側流技術和生物芯片技術，其中ELISA檢測方法特異性強、成本低、穩定好，因此被廣泛應用于轉基因食品安全檢測當中。李小宇等（2016）通過雙抗夾心ELISA檢測技術對轉Bar 基因抗除草劑大豆（膦絲菌素乙酰轉移酶）進行檢測，確定了最低檢測限為0.04ng/ml，ELISA 檢測技術的重復性變異系數小于3%，且根、莖、花、葉、種子不同部位都可檢測到該蛋白的表達[6]。

3 結語

隨著人們對動物源性食品安全問題的關注，操作簡便、高靈敏度和特異性的ELISA 檢測技術被廣泛應用于飼料和食品安全檢測中，為我國畜牧業健康和食品安全提供重要保障，但要想真正解決飼料和食品安全問題，還需要從源頭入手，加強對飼料生產、加工和農獸藥銷售行業的管理，規范養殖戶的飼養方法和藥物使用，減少藥物殘留，為畜禽提供一個健康穩定的環境，才能為廣大人民群眾提供安心安全的動物源性食品。