活體浮游植物色素分析在湖庫生態監測中的應用

陳永玲

（山東省煙臺生態環境監測中心，山東 煙臺 264000）

所謂富營養化，是指湖沼、蓄水池、河川過度吸收氮、磷等營養鹽，使水域的生態結構和功能發生變化，導致藻類、特別是藍藻類的異常增殖現象。許多藻類死后在其分解過程中，不僅發出惡臭，甚至導致魚類的死亡，破壞了自然環境。而且，藻類對水生生物有很大的威脅，可以釋放出威脅飲用水安全和人類健康的生物毒素。作為飲用水和工業用水的供給源，水的富營養化影響了水質的質量，增加了水生產的成本，對社會環境和經濟產生了很大的影響。

近年來，用于檢測植物浮游生物色素的熒光分析技術，逐漸應用于湖沼調查中。作為植物浮游生物機體分類的指標，主要的藻類色素是葉綠素a，葉綠素b，葉綠素c，花青素，纖維葉綠素，胡蘿卜素。葉綠素a存在于藻類中，作為藻類生物物質指標的葉綠素b，及在綠藻類和百合目植物中發現的花青素和葉綠素存在于藍藻類和紅藻類中。紅藻主要生活在海水中，花青素可以作為淡水藍藻類的生物量指標來使用。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

M53（B）熒光光譜儀、Flow成像器（Skalar、荷蘭）、顯微鏡、Axio成像器A1（ZISS、德國）、DR/40U光譜儀（HAH、USA）、真空泵（GAST、英國）、三重吸濾器（Sydolis、德國）、表型慢離心分離器（TDSA WS、Leiber離心分離機，北京）、串珠磨削組織磨床（MB-8，biospec，美國）、纖維素醋酸膜（光柵0.45 m，北京石灰膜分離技術有限公司），植物浮游生物計數框（武漢水生研究所）。

1.2 供試樣品

采樣地點：主要飲用水源、工業水源水庫、主要飲用水源湖和煙臺主要風景湖。采樣時間：2009年4月、7月、9月、2009年5月、7月、2010年9月、2011年5月、7月、2012年9月、5月和2013年8月。

1.3 樣品采集

根據每個水體的實際情況，使用有機玻璃取樣器混合樣品。在每個樣品中采集3～4升的混合樣品。湖沼樣品300 ml，貯 水池樣品500 ml，植物浮游生物定量樣品。剩余的水樣用于生活色素分析。取完水樣后，在低溫暗處保存，于6～8小時內進行預處理。

1.4 水樣前處理

測試葉綠素a的水樣前處理步驟：在抽濾器上裝好乙酸纖維濾膜，倒入定量體積的水樣進行抽濾，抽濾時負壓不能過大（約為50 kPa），否則會破壞藻類細胞組織。水樣抽干后，繼續抽濾1～2分鐘，以減少濾膜上的水分。將抽濾后的濾膜放入墊好濾紙的平皿中，置于冰箱冷藏室，低溫干燥6～8小時。

植物浮游生物定量分析的預處理步驟：取1升水樣到分離漏斗中，加入15 ml的溶液固定，可耐受24小時以上。

1.5 實驗方法

葉綠素a含量分析：在7 ml的塑料離心管中加入5 ml 90%的丙酮溶液，放入2 ml的玻璃珠，將干燥的過濾膜放入離心管中并浸入丙酮中，不含氣泡。放入砂輪的固定孔中，擰緊固定螺母，啟動3～5 m的振動磨床。之后放入冰箱，低溫避光6～24 h后，完全提取了葉綠素a。

離心分離后15分鐘，取出離心分離器的離心分離管，將上清液轉移到體積燒瓶，將體積固定在10 ml。將提取的溶液放入分光光度計中，分別讀取663 nm、645 nm、630 nm、750 nm波長的吸光度值，并將90%的丙酮用作空白以校正吸收率。

2 結果與討論

2.1 水庫樣品測試結果

在蓄水池的試驗樣品中，分別在夏季和秋季兩個主要飲用水源蓄水池中檢測出了花椒氨酸。花青素的檢測率小于10%。春季硅藻優占，夏天硅藻類和綠藻類優占。這些水庫的個體群結構良好，藍藻水華的概率非常低。

煙臺的門樓水庫就是飲用水源地，5年中，春季僅有一次檢出藻藍素，春季藻藍素檢出率為20%，春季浮游植物以硅藻和綠藻為優勢，個別年份春季藍藻門所占比率比較高。夏、秋季節藻藍素檢出率為88%，僅有一次未檢出藻藍素。夏、秋季浮游植物以藍藻門的微囊藻、魚腥藻為優勢種。各季節藻藍素總檢出率為54%，2009年9月出現水華，藍藻細胞數量占浮游植物細胞總數量的91.3%，藻藍素測試值高達1 750 ug/L，2012年8月藻藍素測試值也高達359 ug/L，藍藻細胞數量占浮游植物細胞總數量的94.8%，水體富營養化，僅用作景觀補水和工業用水。

2.2 湖泊樣品分析結果

在6個湖泊樣品中，藻藍素是2009年9月和2011年9月檢測出的，藻藍素的檢測率為15%。春天硅藻類和綠藻類是優占植物浮游生物，夏天和秋天，植物浮游生物群集結構是硅藻、綠藻和藍藻類。水質營養狀態良好，應努力保護，以確保飲用水功能。

在五個湖中的四個，春季藻藍素檢測出少量樣品，春季藻藍素檢測率為10%。在花青素中大部分檢測到夏季和秋季的樣品，夏季和秋季的花青素檢測率為72%。在這些湖泊中，植物浮游生物的個體群結構在春季為硅藻＋硅藻類，硅藻＋綠藻，夏天是綠藻＋藍藻類，秋天是藍藻類。這些湖沼中的花青素檢出率每季節為48%，煙臺的湖沼中，夏季和秋季藍藻類會大量繁殖，有可能引起藍藻污染。

隨著近年來對環境保護所做出的努力，四個湖沼中的兩個開始通過大規模曝氣和海藍養殖等措施，水質的富營養化逐年減少。秋季植物浮游生物群集結構變為藍藻類+藍藻型，湖中的花青素檢測率減少到23%。樣品的檢測率僅為92%。春季，植物浮游生物個體群結構是綠藻+藍藻類，夏季和秋季植物浮游生物個體群結構是藍藻類。這個湖被選擇用來比較近五年每個季節的植物浮游生物，及西蘭花細胞和花青素的數量，并且顯示了用經典方法測量的花青素值和綠素a含量之間的對應關系[1]。

2.3 水污染浮游植物監測

生態系統和群集水平的生物標志通過生物多樣性效應可以顯示水質污濁物質對環境的影響，實現水質污濁的生物學監測。對水質的變化和社區的生態學影響主要通過出現或消失的指標（主要是對特定污染物質敏感或抗藥的物種）來明確植物浮游生物種類或群體的數量及結構變化，結構變化獨立營養從屬營養程度的變化生產性水平的變化。

2.4 水污染浮游植物監測存在的問題

國內外科學家對水質污濁的生物學監測進行了詳細的研究，對研究結果進行了定量、定性分析。這些研究不僅為水質污染的生物學監測提供了豐富的數據，還為水質污染的生物學監測實踐提供了可靠的理論基礎，為研究人員提供特定的研究想法和理論指導。但是，在水質污染的生物學監測研究中，有很多不能忽視的問題（1）生物標記在水質污染的生物學監測中起著重要的作用，但是有很多缺點。第一，生物標志的決定既困難又昂貴。第二，有些生物標志不夠。第三，一些生物標志在實際環境中并不十分敏感。第四，由于在水質的生物學監測過程中選擇了生物，所以同一有機體對污染物的靈敏度和響應在不同的生長時期表現不同，即使同一生物在同一時期也存在個體差異。因此，在監測和評估水質污濁的過程中，生物標志不是全能的。（2）選擇的生物標志應是綜合監測系統的有效部分。生物標志存在于天然的水環境中，不僅受水環境中的污染物影響，還受氣候、季節、地區等諸多因素的影響。因此，只要建立標準化的監測方法并比較結果，該方法就具有應用的價值。水生動物的群集結構和相對量反映了水質污濁的情況，而公式計算出的污染程度數值更好地反映了實際情況，易于比較數據，社區結構和功能本身復雜，影響因素多，而且公害只有其中一個。通過對環境因素的綜合考慮，我們發現了生物群集結構定量變化的本質原因。這與田間復雜的水生生態環境不同。應該盡可能地與研究所結合進行現場調查。確保實驗的真實性，應用大量監測數據進行比對說明，測定不同條件下的各種數據[2]。

3 結論

經典的葉綠素a含量測試是2～3天，用顯微鏡分類植物浮游生物需要時間。由于葉綠體被藍藻類的生物細胞纖維蛋白覆蓋，所以測定的綠素a含量在藍藻類覆蓋下有很大的偏差。然而，通過熒光分析技術測量的花青素值與通過經典方法的測量值，以及通過顯微鏡計數的植物浮游生物數之間有顯著的關聯，可以定量地提供藻類布魯姆形成的初始預警信號。它的應用價值是可以早期預警和監測飲水源。很多種類的藍藻類含有微系統，使用熒光分析與微系統測試相結合，可以提供強大的數據支持來評估飲用水的安全性。