優化sgRNA序列提高斑馬魚CRISPR/Cas9系統的突變效率

呂雙娟，舒林娟，林啟研，李思穎，李丹寧，肖越，莫顯明

(四川大學華西醫院干細胞生物學研究室，成都610041)

基因編輯技術是研究動物基因功能和物種進化基因規律的有效手段，其中最方便的基因編輯技術是CRISPR/Cas9技術。CRISPR/Cas9是一種在細菌和古細菌體內由sgRNA和Cas9蛋白組成復合體(Deltchevaetal.，2011)以抵御外源DNA的適應性免疫防御系統(Horvath & Barrangou，2010；Wiedenheftetal.，2012)。CRISPR/Cas9技術在生物醫學等領域有著廣泛的應用，已經成功地在多個物種中實現了基因組編輯，如斑馬魚Daniorerio(Changetal.，2013；Hwangetal.，2013a，2013b；Xiaoetal.，2013；Yinetal.，2015；Brocaletal.，2016；Gasanovetal.，2021；Shaw & Mokalled，2021)。CRISPR/Cas9復合體通過堿基互補配對識別并與外源靶DNA的互補序列結合，在靶DNA的前間區序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)區上游3 bp引入雙鏈斷裂并通過非同源末端連接或同源定向修復以實現基因的特定編輯(Jineketal.，2012；Congetal.，2013；Jiangetal.，2013；Malietal.，2013)。CRISPR/Cas9基因編輯系統依賴于sgRNA的識別序列與靶點序列的特異性結合。可以通過改變sgRNA序列來增加CRISPR/Cas9系統的靶效應，例如截斷sgRNA的5’端堿基(Choetal.，2014；Fuetal.，2014)或在sgRNA的5’端增加2個G(Choetal.，2014)均可以降低脫靶效應；在斑馬魚體內針對同一基因使用2個sgRNAs造成目的基因的基因組大片段缺失(Xiaoetal.，2013；Hoshijimaetal.，2019)或者針對同一目標位點使用2個互補的sgRNA(Gasanovetal.，2021)可顯著提高CRISPR/Cas9的突變效率。然而，由于基因組的復雜性和sgRNAs對特定堿基錯配的忍耐性(Bolukbasietal.，2016)，sgRNA的識別序列同樣可能與其他非靶DNA序列部分匹配，激活Cas9核酸內切酶活性，導致脫靶效應，從而降低靶DNA的切割活性(Yannietal.，2014；Ewaetal.，2018)。因此，對sgRNA進行特異性和高效性預測具有重要意義。

本研究分析了針對斑馬魚35個基因的157個sgRNAs的序列組成，發現高效的sgRNA具有序列組成偏好性，能夠最大化提高CRISPR/Cas9系統的切割效率。此外，對已發表的sgRNA序列特征進行重新分析以驗證本研究所獲得的序列特征是否具有普遍適用性，便于優化用于CRISPR/Cas9基因編輯和遺傳篩選的sgRNA設計。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與實驗試劑

1.1.1 實驗動物斑馬魚品系為野生型斑馬魚AB和轉基因型斑馬魚(Ifabp:Red/elastase:GFP)。所有動物實驗均經四川大學華西醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 實驗試劑質粒pMD-18T由本實驗室保存；Cas9蛋白(GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease)購自GenScript；體外轉錄試劑盒MEGAscript? T7 Kit購自Thermo Fisher Scientific；T7 EndonucleaseⅠ購自NEB。

1.2 CRISPR靶序列的設計和gRNA的合成

使用CHOPCHOP(Montagueetal.，2014)和Benchling預測和選擇基因中最優的CRISPR/Cas9靶序列。為滿足體外轉錄T7啟動子的要求，本研究中使用的大部分靶點以5’-GG開頭。然而，在某些基因上選擇5’-GG開頭的sgRNA較難，因此將序列要求放寬為5’-GN-3’。此外，每個基因至少設計3個不同的sgRNAs。

用特異性引物(表1)以sgRNA骨架質粒pMD-18T(含T7啟動子、RNA支架和氨芐青霉素抗性)為模板，使用Q5高保真酶進行PCR擴增，得到sgRNA體外轉錄模板。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳進行單一條帶(125 bp)確認后直接純化回收。

表1 sgRNA模板擴增引物

1 μg sgRNA模板通過試劑盒進行體外轉錄并通過LiCl沉淀法純化回收。

1.3 胚胎注射及sgRNA切割活性檢測

通過顯微注射將1 nL的sgRNA和含有核定位信號(NLS)的Cas9蛋白的混合液(終濃度為250 ng sgRNA/μL和150 ng NLS-Cas9 NLS/μL)注射到野生型斑馬魚AB胚胎單細胞期的細胞質中。每種sgRNA注射300多枚胚胎，在檢測切割活性后，將剩余的胚胎培養至成年，形成F0代。

T7EⅠ核酸內切酶特異性識別和切割異源雙鏈DNA錯配。顯微注射24 h后，隨機收集8枚未注射的胚胎作為對照，同時隨機收集至少18枚(6枚/管)注射后的胚胎來鑒定靶點sgRNA的有效性。用堿裂解法提取胚胎基因組并以此為模板進行PCR擴增。利用T7EⅠ核酸內切酶選擇性地消化PCR產物中的異源雙鏈DNA，通過比較對照組與實驗組的瓊脂糖凝膠圖譜上條帶的數量來確定突變頻率。將非單一條帶的PCR產物進行Sanger測序，確保基因的靶向有效性和突變效率。

1.4 種系突變的篩選

確認sgRNA活性后，將剩余的胚胎或2～3個有效sgRNAs共注射的胚胎培養至成體，并通過剪尾鰭確定其是否發生有效突變。經T7EⅠ核酸內切酶檢測和Sanger測序初步篩選后，將F0代與野生型斑馬魚雜交獲得F1代。待其長至1.5個月左右，對每條F1進行剪尾鰭鑒定和Sanger測序，獲得攜帶移碼突變的F1突變體。將具有相同突變類型的F1突變個體進行交配獲得F2代。理論上F2代應包括純合子突變個體、雜合子突變個體和野生型突變個體。將雌雄純合子突變體F2進行交配，獲得穩定遺傳突變種系。

2 結果

2.1 CRISPR/Cas9是斑馬魚產生突變的有效方法

運用ChopChop和Benchling設計并檢測了35個斑馬魚基因中的157個sgRNAs(附件)。首先利用T7EⅠ核酸內切酶檢測和Sanger測序，檢測每個sgRNA的切割活性。結果表明，75個sgRNAs(47.8%)有效。為了獲得更準確的序列特征，剔除了Tcf4基因，因為其19個sgRNAs的切割活性檢測結果均顯示無效。靶點有效率提高至54.3%(圖1)，并且F1代鑒定測序顯示35個基因中有 34個(97%)均發生了可遺傳的種系突變。為了驗證157個sgRNAs活性序列特征的有效性，從現有的sgRNA文庫中重新分析了959個sgRNAs。959個sgRNAs的效率顯示出類似的結果(圖2：a)。

2.2 GC含量為50%～60%的序列具有較好的切割效率

為了更好地探索CRISPR/Cas9系統的sgRNA序列組成在斑馬魚中的影響，分析了本研究的 138個sgRNAs和已發表的959個sgRNAs的序列特征。首先比較所有靶點sgRNAs的GC含量分布(忽略PAM中NGG上的GG)。在整個靶點序列(20 bp)中，GC含量為50%～60%的有效靶點明顯高于無效靶點(圖3：a)，同時在已發表的959個sgRNAs中也存在這一趨勢，盡管GC含量為45%和65%的sgRNAs在切割方面略有優勢(圖2：b)。對sgRNAs的12個種子序列(近PAM端1～12位堿基)進行GC含量分析，50%～58%的GC含量在sgRNA種子區域有明顯的富集現象(圖3：b)，而已發表的959個sgRNAs中,種子序列的GC含量PAM.前間區序列鄰近基序protospacer adjacent motif; 下同，the same below為42%～67%(圖2：c)。

2.3 5’-GA的sgRNA降低CRISPR/Cas9系統的切割效率

sgRNA序列中核苷酸的組成可能會影響CRISPR/Cas9系統的靶向切割效率，故分析了所有sgRNAs序列上重要位置的核苷酸偏好性。首先，比較了有效靶點和無效靶點的前2位堿基的組成。結果顯示，與5’-GG sgRNAs相比，5’-GA sgRNAs的切割效率顯著降低(P=0.037)(圖3：c)。對已發表的959個sgRNAs的前2位堿基偏好性統計表明，5’-GA sgRNAs序列的切割效率也明顯較低(P=0.021)(圖2：d)。

2.4 PAM的可變核苷酸偏好C而排斥A

為了評估sgRNA活性與PAM可變核苷酸之間的關系，以無活性sgRNAs作為陰性對照，比較了活性sgRNAs的PAM可變核苷酸的堿基偏好性。結果表明，AGG和CGG之間存在顯著差異(P=0.026)(圖3：d)。PAM的第一個核苷酸為C能顯著提高靶點的切割效率，而PAM可變核苷酸為A的sgRNAs則會明顯降低靶點活性。在已發表的959個sgRNAs中(圖2：e)同樣觀察到PAM可變核苷酸對C的偏好。

2.5 第17位堿基為C的sgRNA具有較高的切割效率

sgRNA的有效性同樣取決于Cas9蛋白與sgRNA的結合效率。對sgRNA真正的“種子”區域(鄰近PAM 5’端的5位堿基序列，即16～20 nt)的堿基分布進行評估。結果顯示，除了在第17位堿基上存在明顯的偏好C而排斥T外(P=0.034)，第16、18、19、20位堿基上無顯著的堿基偏好性，盡管與無效靶點相比，有效靶點在這4個位置出現G和C的頻率都略高(圖4：a～e)。已發表的959個sgRNAs的第17位堿基上也存在對C的偏好性(P<0.000 1)(圖2：f)。同時還觀察到，當CRISPR/Cas9系統的切割位點堿基對(第17/18位堿基)為AC時，sgRNAs具有較高的靶切割效率(圖4：f)，但無顯著差異(P=0.07)。對已發表的959個sgRNAs的切割位點堿基偏好性的統計分析表明，第17/18位堿基為AC的sgRNAs比其他sgRNAs具有顯著的優勢(P<0.05)(圖2：g)。

2.6 優化的sgRNA設計原則具有普遍適用性

為了驗證sgRNA的設計原則在其他物種中的普遍適用性，再次分析959個sgRNAs中非斑馬魚基因相關基因的607個sgRNAs的序列特征。結果顯示，607個sgRNAs的靶點序列和種子序列中的GC含量與之前的結果完全吻合(圖5：a，b)；5’-GA sgRNAs和5’-GG sgRNAs之間仍然存在顯著性差異(P=0.049)(圖5：c)；PAM可變堿基偏好C，而排斥T(P=0.001)，雖然與之前的結果略有不同，但都表明在設計sgRNA時，最好選擇C作為PAM的可變堿基(圖5：d)；最后對第17位堿基及CRISPR/Cas9切割位點的堿基分布統計發現，C在第17位堿基有明顯優勢(P<0.001)(圖5：e)，而且切割位點的堿基對為AC的sgRNAs也有明顯的優勢(P<0.001)(圖5：f)。

3 討論

本研究檢測了影響sgRNA切割效率的重要參數，包括GC含量、5’端雙核苷酸組成、PAM的可變堿基組成和Cas9核酸內切酶切割位點的堿基偏好性，發現通過優化相關參數可以提高斑馬魚CRISPR/Cas9系統的基因突變效率。同時為了驗證結果的普遍適用性，本研究分析了已發表的大量sgRNA序列，包括352個斑馬魚相關基因的sgRNAs(219個有效和133個無效)、279個人類Homosapiens相關基因的sgRNAs(133個有效和146個無效)和328個人類與小鼠Musmusculus相關基因的sgRNAs(164個有效和164個無效)(Doenchetal.，2014；Gagnonetal.，2014；Charietal.，2015；Shahetal.，2015；Varshneyetal.，2015；Shaw & Mokalled，2021)。其中，631個斑馬魚和人類相關基因的sgRNAs的靶點序列及靶點有效性直接從文獻中獲得，但并未提及具體的突變效率。328個人類與小鼠相關基因的sgRNAs來源于Doench等(2014)中提及的1 841個sgRNAs。為了較準確得到有效靶點與無效靶點的序列特征，選擇突變效率>0.5的164個sgRNAs為有效靶點，同時選擇相應效率最低(突變效率<0.02)的164個sgRNAs作為無效靶點。

雖然現在有很多軟件可以幫助設計出高效的sgRNA(Charietal.，2015；Wongetal.，2015；Xuetal.，2015)，但所獲得的高效率靶點也存在一定的缺陷,并且軟件的效率評分高低不能代表真實的切割活性。因此，在設計sgRNA時，每個基因可設計3～4個sgRNAs，且必須在體內驗證其切割活性后，選擇高效率的sgRNA進行下一步實驗。雖然已有研究表明，GC含量為40%～80%的sgRNAs具有切割效率(Gagnonetal.，2014；Wangetal.，2014)，但本研究發現，GC含量為50%～60%的sgRNAs序列有更好的切割效率。堿基對錯配的忍耐性(Hsuetal.，2013)以及5’端GG(Hwangetal.，2013a，2013b)的存在會影響sgRNA的GC含量。本研究對sgRNA種子序列(Jineketal.，2012；Shangetal.，2015)中的GC含量分布進行分析發現，GC含量為50%～60%的sgRNAs同樣具有高效的切割效率。Gagnon等(2014)的研究表明，與5’-GG sgRNAs相比，5’-GA sgRNAs的切割效率只存在輕微下降(P>0.05)；而本研究發現，與5’-GG sgRNAs相比，5’-GA sgRNAs的切割效率顯著降低(P=0.037)。

CRISPR/Cas9系統利用PAM識別靶DNA序列中潛在的靶點,同時PAM有助于Cas9蛋白與靶DNA的結合(Sternbergetal.，2014)。CRISPR/Cas9系統的PAM通常為NGG。對所有sgRNAs的PAM的可變堿基“N”進行統計分析，發現C的頻率在有效靶點中占有絕對優勢，這與以前的研究結果一致(Gagnonetal.，2014)；但本研究結果顯示，A大量存在于無效靶點中，而不是T(Doenchetal.，2014)。因此在設計sgRNA時，最好選擇C作為PAM的可變堿基，同時避免T和A。CRISPR/Cas9系統識別靶點后，Cas9蛋白的2個核酸內切酶(HNH核酸內切酶和RuvC核酸內切酶)分別在PAM 5’端上游3 bp和4 bp之間(第17/18位堿基)切割DNA鏈的互補鏈與非互補鏈，導致DNA雙鏈斷裂(Jineketal.，2012；Shenetal.，2013)。對sgRNA真正“種子”區域(Wuetal.，2014)的堿基組成以及切割位點的堿基組成分析發現，C在第17位堿基有明顯優勢，而且切割位點為AC的sgRNAs也有明顯的優勢，但同時也應該避免切割位點為AA、TT和GG的sgRNAs。

對已發表的sgRNA相關參數的分析表明，本研究優化的sgRNA設計原則具有可使用性，并且在其他物種中具有普遍適用性。這些發現為動物(尤其是斑馬魚)體內設計最有效的sgRNA提供了一個可行的框架，也為發育生物學研究中的sgRNA設計提供了便利。