基于微衛星和線粒體的四川白水河國家級自然保護區林麝遺傳多樣性研究

胡大明，侯真真，鄧承敏，陳旭，吳杰，陳磊，陳勤，岳碧松，張修月*

(1.四川白水河國家級自然保護區，四川彭州611930；2.四川大學生命科學學院，瀕危動物繁殖與保護遺傳四川省重點實驗室，成都610065；3.四川省養麝研究所，四川都江堰610016)

林麝Moschusberezovskii隸屬鯨偶蹄目Cetartiodactyla麝科Moschidae麝屬，國家一級重點保護野生動物，CITES附錄Ⅰ物種(Smith，解焱，2009；魏輔文等，2021)。雄性林麝分泌的麝香是名貴中藥材，也是高級香水和香料的原材料，具有極高的藥用和經濟價值(王海燕等，2006；王淯等，2006)。受經濟利益和市場需求驅使，野生林麝一度受到大量獵殺，加上棲息地喪失等，我國野生林麝種群數量急劇下降，由20世紀60年代的250余萬頭下降到 20世紀90年代的10余萬頭(盛和林，1996)。盡管我國從20世紀50年代已開始林麝的人工馴養與繁殖研究，但由于疾病、遺傳等因素影響，圈養林麝種群數量增加緩慢、規模養殖困難(袁陽等，2020)。因此，精確了解野生資源和遺傳狀況對林麝保護和資源利用具有重要意義。

近年來，瀕危動物種群及其棲息地得到了較好的保護，但野生林麝資源的研究多是基于糞便、毛發等痕跡開展的種群密度及數量估算(胡忠軍等，2007；姚剛，2014；姜海瑞等，2015；胡大明等，2019；王霞等，2020)，僅有2個對野生種群遺傳多樣性的研究：馮慧等(2014)基于mtDNA D-Loop和姚剛(2014)基于主要組織相容性復合體對野生種群和圈養種群的比較，但受選用的分子標記限制，沒有基于個體識別的遺傳多樣性調查。

微衛星是目前應用得最廣泛、最優良的分子標記，能夠進行精確的個體識別和遺傳多樣性估算。白水河國家級自然保護區內林麝具有一定的種群數量(胡大明等，2019；彭科等，2021；溫平等，2021)，但林麝種群遺傳多樣性未有報道。本研究基于微衛星和mtDNA D-Loop序列對保護區林麝進行遺傳多樣性研究和種群數量估計，了解保護區林麝種群數量和遺傳狀況，為野生林麝保護提供基礎資料。

1 研究地概況

四川白水河國家級自然保護區位于四川省彭州市龍門山鎮和小魚洞鎮(103°41′～103°57′E，31°10′～31°29′N)，總面積301.50 km2，野生動植物資源豐富，生態環境良好(胡大明等，2019)。

2 材料與方法

2.1 樣品采集

1份圈養林麝肝臟樣本來自四川省米亞羅養殖場，10份圈養林麝糞便樣本來自四川養麝研究所都江堰養麝場，46份野生林麝糞便樣本來自白水河國家級自然保護區(表1)，所有標本保存于四川大學生命科學學院生物資源與生態環境教育部重點實驗室。野外糞便樣品采用樣線采集，樣線設置在20條保護區日常監測線路內(根據糞便顏色和狀況采集5 d以內的糞便)，每條線路選擇 3～7條樣線，每條樣線長3 km。

表1 46份野生林麝糞便樣本采樣信息

2.2 DNA提取及PCR擴增檢測

分別使用M5 HiPer Universal DNA Mini Kit超強通用型DNA提取試劑盒MF033-plus-04(北京聚合美生物科技有限公司)和土壤/糞便DNA提取試劑盒TD601-50(北京天漠科技開發有限公司)提取林麝肝臟以及糞便DNA。提取的DNA-20 ℃保存備用。

PCR擴增體系總體積為25 μL，其中，正、反引物各1 μL、2×PCR Mix 12.5 μL、肝臟0.5 μL、糞便DNA 2 μL，用ddH2O補齊。S1000TM Thermal Cycler進行PCR擴增，程序為：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 10 min;4 ℃保存。

2.3 適于糞便DNA擴增的微衛星位點篩選

林麝微衛星位點已有較多報道，但有穩定擴增特性的四堿基微衛星位點較少，且用于糞便DNA擴增的報道更少。糞便等非損傷性取樣的DNA一般量少且降解嚴重，其質量比其他組織DNA差，位點擴增能力也較差，因此本研究從林麝基因組序列以及盧婷(2017)已篩選的四堿基微衛星中重新挑選了部分四堿基微衛星位點進行優化。使用Krait v1.0.3(Duetal.，2017)從林麝基因組中預測潛在的多態性四堿基微衛星標記，使用Primer Premier 5.0設計引物，送北京擎科梓熙生物技術有限公司合成備用。根據引物參考Tm值設置溫度梯度、使用肝臟DNA進行PCR條件優化。使用圈養林麝糞便DNA篩選優化后具有穩定擴增的引物對，選出能穩定擴增的引物對用于野生林麝糞便DNA的擴增。

PCR擴增體系和程序如2.2，擴增產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取5 μL送北京擎科梓熙生物技術有限公司基因分型。基因分型在ABI3730 DNA Analyzer上進行，使用GeneMapper version 4.0決定樣本的等位基因數，等位基因大小相對于分子內標GS500LIZ決定。

2.4 野生林麝糞便鑒定及個體識別

野生林麝糞便使用COⅠ基因進行分子鑒定，引物序列：COⅠ-F：5’-ATAGCATTTCCCCGGA-3’，COⅠ-R：5’-TGTTCAGGTTTCGGTCTGT-3’，產物長度300 bp。PCR擴增后經電泳檢測，產物條帶清晰單一、長度與預期一致，送北京擎科生物科技有限公司測序，測序后使用BLAST在線比對鑒定。

利用MICRO-CHECKER(Oosterhoutetal.，2010)評估基因分型數據庫數據的準確性；利用Cervus(Marshalletal.，1998)，以各位點的期望雜合度(HE)、觀察雜合度(HO)以及多態信息含量(PIC)選擇最優位點排列順序，進行基于微衛星分型數據的林麝個體鑒定，并計算PID和PID(sib)。PID為一個群體中隨機抽取的2個不相關個體有完全相同基因型的概率，PID(sib)為一個群體中隨機抽取2個同父同母的個體有完全相同基因型的概率(Kalinowskietal.，2010)。當PID<0.001且PID(sib)<0.01時，則得到個體識別所需最少數量的微衛星位點(Waits，2001)。

2.5 遺傳多樣性評估

通過MEGA 5.2(Tamuraetal.，2011)對線粒體D-Loop成功測序的序列進行比對，比對無誤的序列利用DnaSP v5(Rozas，1995)計算遺傳多樣性指標參數：單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣性(π)。

基因分型結果利用MICRO-CHECKER校正和評估，檢測基因分型數據結果的可信度；利用Cervus 3.0.7計算等位基因數(A)、HE、HO以及PIC等參數。衡量微衛星位點變異程度的重要指標是PIC：PIC>0.5為高度多態性，0.5>PIC>0.25為中度多態性，PIC<0.25為低度多態性。哈迪-溫伯格平衡(HW平衡)檢驗利用Genpop1.2(Raymond & Rousset,1995)進行，種群內Wright近交系數(Fis)使用PopGene1.31計算(Yehetal.，1999)。

2.6 種群數量及密度估算

式中，n為樣線數，xi為第i條樣線的林麝個體數，Li為第i條樣線面積。

式中，S為保護區內林麝適宜棲息地總面積。

3 結果

3.1 樣本采集及林麝糞便樣品的鑒定

經糞便形態初步鑒定，在20條樣線上采集到林麝糞便樣品49個，經COⅠ鑒定為 46份林麝樣品。

3.2 微衛星位點的篩選

利用Krait v1.0.3從林麝基因組中預測獲得33個四堿基微衛星位點，加上盧婷等(2017)篩選的8個位點，共41個位點。以肝臟DNA和圈養林麝糞便DNA為模板，篩選出能穩定擴增的引物 7對。對篩選出的7對引物進行雙色熒光標記(FAM或HEX)(表2)。

表2 適于林麝糞便DNA擴增的7個微衛星位點信息

3.3 林麝個體識別

按照LS-22、LS19、LS-21、LS-33、LS-17、LS-34、LS-23的順序逐個增加用于個體識別的微衛星位點，對使用6個及以上微衛星位點能成功擴增的糞便樣品進行微衛星分型，得到分型數據庫。利用Cervus3.0.7按照位點的HO對分型數據進行個體識別模擬分析，當使用7個微衛星位點進行個體識別時，在46份樣本中識別出30只林麝，PID(sib)<0.01(表3;圖1)，這符合種群大小精確評估的要求。

3.4 遺傳多樣性分析

3.4.1 D-Loop序列特征及遺傳多樣性評估對46份林麝糞便DNA進行線粒體D-Loop的PCR擴增，23份能夠成功擴增并測序，序列長584 bp，堿基含量為A(32.34%)、G(14.17%)、T(31.65%)和C(21.84%)，23個序列共39個多態性位點，占比6.68%。使用DnaSP定義了6個單倍型，Hap2擁有最多的個體數，為10個(表4)。遺傳多樣性指標：h=0.721 3，π=0.023 44。

表4 林麝23個(6個單倍型)D-Loop序列(584 bp)的堿基組成

3.4.2 微衛星標記的遺傳多態性評估7個位點的等位基因數為3～7，共35個。其中，等位基因數≥6的2個，占28.57%；等位基因數=5的3個；位點LS-34的等位基因數量最多(7個)，位點LS-33的最少(3個)。保護區野生林麝種群的Ho為0.211～0.800，平均0.563；HE為0.475～0.798，平均0.602；PIC為0.419～0.750，平均0.536；種群內的Fis為-0.143 7～0.555 6；3個位點符合HW平衡(P>0.05)，2個顯著偏離HW平衡(0.01

表5 基于微衛星標記的白水河國家級自然保護區林麝種群遺傳多樣性分析

3.5 保護區林麝種群數量估計

利用林麝個體識別結果，計算出樣線內林麝的平均密度為4.39頭·km-2，按照保護區林麝適宜棲息地面積約248.31 km2(胡大明等，2019)計算，保護區內林麝的種群數量約為1 090頭。

4 討論

物種遺傳多樣性水平與物種進化潛力密切相關(Frankham，1995)，因此瀕危物種遺傳資源保護是物種保護的核心內容。了解瀕危物種遺傳多樣性狀況，是制定有效保護措施的基礎。在瀕危動物保護遺傳研究中，通常采用糞便、毛發等非損傷性取樣，獲得的DNA不但量少且質量較差，因此獲得適于非損傷性取樣樣本DNA擴增的遺傳標記尤為重要。本研究基于基因組和發表的微衛星位點，篩選到7個四堿基的多態性微衛星位點，在圈養林麝 1 d 的糞便中能穩定擴增，對白水河國家級自然保護區獲得的46個林麝糞便DNA樣本擴增結果顯示，在大部分樣本中能成功擴增，并且基于 7個位點在46個樣本中鑒定到30只林麝個體，表明這些位點能夠應用于基于糞便DNA的野生林麝保護遺傳學研究。

與微衛星位點的等位基因數量相比，雜合度不受樣本數量的影響，是種群遺傳多樣性評估的較好參數。黃杰等(2013)利用7個微衛星位點對米亞羅圈養林麝進行遺傳評估，平均HE和HO分別為0.854和0.782，王豆等(2019)使用13對微衛星檢測巴山、秦嶺和川西林麝3個圈養群體，平均HE和HO分別為0.830 2和0.389 7，表明這些圈養種群保存了較高的遺傳多樣性水平。野生種群微衛星多樣性水平還未見報道，本研究基于微衛星檢測到白水河保護區林麝種群的平均HE和HO為0.602和0.563，處于中等水平。因使用的位點不同，種群間遺傳多樣性比較受限，因此在林麝的保護工作中，應聯合相關部門開展標準化微衛星標記系統的研究，建立共享平臺，方便種群間比較研究。

HW平衡是評價種群遺傳平衡的參數，處于遺傳平衡的種群不容易受到近交及外來種群的干擾(楊建寶等，2012)，種群相對穩定。瀕危物種常常表現HW平衡偏離(Ardrenetal.，1999)，造成偏離的原因很多，如近親交配、種群遷移和遺傳漂變等。本研究中有4個位點偏離HW平衡，均為雜合不足，且表現為近親繁殖。保護區林麝種群表現這些遺傳特征的原因有待進一步研究。

線粒體D-Loop是遺傳多樣性評估的常用分子標記。保護區野生林麝種群線粒體控制區與先前報道的線粒體控制區富含AT的結論一致(Brownetal.，1986)，且G含量明顯低于其他堿基，表現出較明顯的堿基偏倚。Peng等(2008)對四川3個圈養林麝種群進行了D-Loop多樣性評估，結果發現米亞羅種群的h和π分別為0.752和0.029 9、金鳳山種群的為0.830和 0.028 2、馬爾康種群的為0.836和0.056 8，馮慧等(2014)把陜西1個圈養種群和3個野生種群混合進行D-Loop遺傳多樣性分析，發現了較高的單倍型多樣性(h=0.929)和核苷酸多樣性(π=0.044 24)，但這種混合種群研究可能高估遺傳多樣性水平。本研究在鑒定的30只個體中，成功擴增了21只個體，鑒定了6個單倍型，h和π分別為0.721 3和0.023 44，比圈養種群低，可能因為圈養種群建群者來源于多個野生種群。

目前對于林麝野生種群遺傳多樣性評估報道較少，無法評估各野生種群間遺傳多樣性差異，為了更好保護林麝，今后應大力開展類似研究工作，以全面了解我國林麝遺傳資源狀況。