不同骨移植材料應用于犬拔牙位點保存的實驗研究

周 蓉， 束 為， 陳 武

目前種植是修復缺牙的最佳選擇，而拔牙后牙槽嵴出現不可逆吸收，牙槽嵴高度和寬度不同程度減少，頰側骨板吸收多于舌側[1-3]，這導致拔牙后牙槽嵴形態改變，種植體很難獲得理想的植入位置。為減少拔牙后骨吸收，實現種植的長期穩定與功能，臨床上常使用骨移植材料進行位點保存[4-7]。目前臨床用于位點保存效果較好的材料有異種骨去蛋白牛骨礦物質(deproteinized bovine bone mineral, DBBM)[8-10]，吸收速率較慢，Maiorana等[9]的研究發現在DBBM用于牙槽嵴保存后6個月，移植材料剩余顆粒占31.97%，Lindgren等[11]發現骨增量3年后DBBM剩余顆粒依然占到了24%。同種異體骨以脫鈣凍干骨也稱為脫鈣骨基質(DBM)、凍干骨等形式在位點保存中應用，研究表明同種異體骨有良好的保存牙槽嵴形態、骨引導、骨誘導的作用[12-15]，但同種異體骨用于位點保存對后期種植的長期療效等方面影響的研究較少。本課題組前期研究將含不同比例松質骨、皮質骨及DBM的同種異體骨1(松質骨∶皮質骨∶DBM質量比為0∶9∶1)和同種異體骨2(松質骨∶皮質骨∶DBM質量比為3∶6∶1)應用于兔拔牙位點保存，研究發現同種異體骨材料能夠維持牙槽嵴形態，也能誘導新骨形成[16]。

為進一步探究幾種骨材料的作用及對骨結合的影響，本實驗將犬同種異體骨1、2(后文簡稱骨1、骨2)以及DBBM用于犬位點保存，比較3種骨粉保存牙槽嵴的效果、新骨形成情況以及位點保存位點植入種植體后的骨結合情況，希望能找到合適的骨移植材料用于位點保存，在達到減少牙槽嵴吸收的同時能有更多的新骨形成，利于后期種植體的骨結合。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

13～14個月齡健康雄性比格犬兩只，體質量10～14 kg，南京市第一醫院動物實驗中心提供并飼養。

同種異體骨粉1、2(北京大清生物制藥生物技術股份有限公司)；去蛋白牛骨礦物質骨粉Geistlich Bio-Oss?(Geistlic，瑞士)；種植體紐白特IS-Ⅱ active ?3.5 mm×10.0 mm(Neobiotech，韓國)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型及實驗分組 已通過南京醫科大學倫理審查(IACUC-1901052)。拔除兩只比格犬雙側下頜的第二、三、四前磨牙，共12個牙位，隨機分為A、B、C、D 4組。A組，空白組，拔牙窩自然愈合；B、C、D組拔牙窩內分別填塞骨1、骨2和DBBM。

1.2.2 實驗過程 比格犬稱重，0.1 mL/kg陸眠寧誘導麻醉，靜滴丙泊酚(0.5 mg/(kg·min))維持。雙側下頜術區局麻，分根，微創拔除，骨壁完整無破壞。按分組在牙槽窩內植入骨1、骨2、DBBM骨粉，充填至平齊頰側牙槽嵴頂，覆蓋醫用膠原蛋白，空白組不植材料，水平褥式縫合。

拔牙位點保存術后3個月行種植手術，同上方法麻醉、翻瓣，測量，用內徑2 mm、外徑3 mm的環狀取骨鉆分別于第二、三、四前磨牙遠中根牙槽窩中央的位置取骨，取出直徑為2 mm、高8 mm的圓柱狀骨，在取骨處繼續制備種植窩洞，植入3.5 mm×10.0 mm種植體1枚，置封閉螺絲。種植體植入后3個月處死比格犬，分離牙齦，分離下頜骨，制取標本，進行實驗觀察。

1.2.3 觀察指標和方法 ①大體形態學檢測，以第一前磨牙和第一磨牙釉牙骨質界的連線作為參照，自制卡尺記錄每個牙位近遠中根牙槽窩頰側牙槽嵴頂中央的位置，游標卡尺測量拔牙術后即刻、拔牙后3個月每個牙根對應的牙槽窩及拔牙后6個月時每個牙位近中根牙槽窩的頰側牙槽嵴頂中央距離參照線的垂直距離，記為H0、H3、H6，比較各組之間拔牙后3、6個月時與基線相比頰側牙槽嵴垂直高度的變化，分別用ΔH1、ΔH2表示。

因舌側牙槽嵴相對穩定，吸收少，測量拔牙術后即刻、拔牙后3個月每個牙槽窩及拔牙后6個月每個牙位近中根牙槽窩舌側牙槽嵴頂下方2 mm處牙槽嵴的水平寬度，記為W0、W3、W6，比較各組間拔牙后3、6個月與基線相比牙槽嵴水平寬度的變化,分別用ΔW1、ΔW2表示。所有數據的測量均由同一位術者完成。

3個月時每組樣本量為6，6個月時因遠中牙槽窩已行種植，僅測量比較每個牙位的近中牙槽窩的高度、寬度變化，所以每組樣本量為3。

②組織學檢測，將柱狀骨標本置于4%甲醛固定24 h，10%EDTA脫鈣，HE染色。光學顯微鏡下觀察各組骨形成情況。選取標本中央的切片用于組織學分析。Image J軟件計算各組的新生骨、剩余骨材料、結締組織及其他組織的百分比，比較各組間的差異。

術后6個月下頜骨標本進行固定、梯度脫水，透明、包埋，制作磨片。Van-Gieson染色觀察。于20倍光鏡下每個種植體隨機選3個螺紋近遠中各6個斜面作為觀測視野,采用IPP 6.0軟 件 進 行 圖 像 分 析 測 量 ,按以下公式計算骨-種植體結合率。 骨-種植體結合率(bone-implant contact, BIC)=骨-種植體接觸長度÷種植體總長度×100%。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 位點保存的效果

頰側牙槽嵴頂高度及牙槽嵴寬度變化：術后3個月各組的頰側牙槽嵴高度、寬度均降低，經方差分析4組之間頰側牙槽嵴高度的減少量ΔH1及牙槽嵴寬度的減少量ΔW1差異均有統計學意義(P<0.05)，組間兩兩比較A組和C組分別與其他3組相比，ΔH1、ΔW1差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 術后3個月頰側骨高度和舌側牙槽嵴頂下2 mm處頰舌向寬度變化Tab.1 The changes of buccal alveolar crest height and the changes of ridge width 2 mm below the ligual alveolar crest 3 months after operation mm

經方差分析，術后6個月各組的近中根處頰側牙槽嵴高度及寬度均降低，4組之間的ΔH2、ΔW2差異均有統計學意義(P<0.05)，A組與其他3組相比ΔH2、ΔW2差異均有統計學意義，C組與D組之間高度變化的差異有統計學意義(表2)。

表2 術后6個月頰側骨高度和舌側牙槽嵴頂下2 mm處頰舌向寬度變化Tab.2 The changes of buccal alveolar crest height and the changes of ridge width 2 mm below the ligual alveolar crest 6 months after operation mm

2.2 組織學觀察

位點保存術后3個月，各組標本都可觀察到大面積礦化組織，有成熟骨小梁形成。B、C組新生骨的面積較大，高倍鏡下可見成熟的哈弗系統，骨陷窩豐富。A組骨陷窩不如C組豐富，高倍鏡下可見成骨細胞活躍，有未成熟的哈弗系統。比較A組還可見部分纖維結締組織包繞新骨形成，新生骨形態排列不規律。

B、C、D組中均可見剩余材料顆粒，殘留顆粒周圍是含有骨細胞陷窩的礦化結構，為新生骨，D組可見少量Bio-Oss骨顆粒周圍被纖維結締組織包繞(圖1)。

組織學統計分析：各組新生骨比例差異無統計學意義(P=0.072)，A組無剩余材料，與其余3組之間有差異(P=0.001)，其余3組剩余材料的比例為差異無統計學意義(P=0.083)。A組的結締組織比例與其余3組有統計學差異，B、C、D 3組之間差異無統計學意義(表3)。

表3 各組織成分的組織學分析Tab.3 Histomorphometricanalysis of different components %

骨形態計量學分析：各組種植體周圍均可見新生骨及成熟的骨小梁結構，種植體與骨緊密結合，C、D兩組成熟骨小梁較A、B組多(圖2)。A組的種植體骨結合率與其他3組相比差異有統計學意義，其余3組間差異無統計學意義(表4)。

表4 骨-種植體結合率Tab.4 Bone-implant contact

GP：剩余材料顆粒，NB：新生骨，CT：結締組織，箭頭：成骨細胞，星號：血管；A：空白組( ×100)；B：同種異體骨1( ×200)；C：同種異體骨2( ×200)；D：DBBM組( ×200)，剩余移植骨顆粒被結締組織包繞圖1 HE染色觀察位點保存術后3個月后牙槽窩內成骨情況Fig.1 Histological observation of 3 months after extraction site preservation with hematoxylin-eosin staining

3 討 論

種植體骨結合與植入區骨質和骨量密切相關，理想的位點保存骨材料除了能較好地維持牙槽嵴高度和寬度外，還需有良好的骨引導及骨誘導性、合適的吸收速率，有足夠的新骨形成，為種植體的植入提供良好的骨質[17]，利于與種植體形成良好的骨結合。 De Risi等[18]的系統綜述發現不同骨材料的吸收速率是有差異的，異種骨和人工骨的吸收速率慢，剩余材料比例最高，同種異體骨剩余材料比例最低。而剩余材料顆粒過多可能會影響新骨的形成，從而影響種植體的骨結合。DBBM具有良好的骨引導性，但是沒有骨誘導性，吸收速率緩慢。同種異體骨來源廣泛，有骨引導、骨誘導性。本實驗中的骨1、骨2中的皮質骨和松質骨都是犬的同種異體凍干骨，有骨引導性，加入的脫鈣骨基質DBM不僅有骨引導性，還有骨誘導性，有利于新骨的形成。

A：空白組；B：同種異體骨1；C：同種異體骨2；D：DBBM組圖2 種植術后3個月時組織學觀察(Van-Gieson染色 ×100)Fig.2 Histological observation of 3 months after implantation (Van-Gieson staining ×100)

本研究結果表明DBBM的牙槽嵴保存效果最好，皮質凍干骨和DBM混合的同種異體骨材料的位點保存效果與DBBM相似，含30%松質骨的同種異體骨也有較好的牙槽嵴輪廓保存效果，較DBBM稍差，這與本課題組前期研究結果一致[16]。C組材料骨2是30%松質骨、60%皮質骨和10%DBM的混合物，3個月時C組的牙槽嵴高度、寬度減少量大于B組，差異有統計學意義，這可能與松質骨吸收速率較快有關，Eskow等[19]分別將100%同種異體凍干皮質骨和100%同種異體凍干松質骨用于位點保存，約18周后，發現松質骨組牙槽嵴高度降低更多。而6個月時B組與C組的頰側牙槽嵴骨高度以及寬度變化均無統計學差異，這可能是因為骨2中也含有60%的皮質骨，后期吸收速率趨于穩定，且新骨不斷形成改建。

本研究觀察到在位點保存術后3個月，不論是自然愈合還是拔牙窩內充填骨材料，牙槽窩都有較多新生骨組織、成熟骨小梁形成。在其他犬的實驗研究中也發現，骨缺損區植入骨移植材料后3個月已經形成成熟的板層骨結構[20]。C組即骨2組的新生骨比例最大，自然愈合組最小，新生骨比例為C>B>D>A，無統計學差異，但這也在一定程度上反映了3種骨移植材料均可以促進新骨形成。Froum等[21]的研究發現自然愈合組和同種異體脫鈣凍干骨(DFDBA)組的新生骨比例分別為32.4%、34.7%，差異無統計學意義。Demetter等[22]比較了不同比例皮質骨、松質骨混合的同種異體凍干骨(FDBA)，用于人磨牙位點保存后新生骨的比例，各組間也無統計學差異。

Lindgren等[11]發現骨增量3年后DBBM剩余顆粒依然占到了24.0%±13.5%，DBBM的低替代率可能會影響牙槽窩內骨的重建進而導致拔牙窩內的新骨形成減少，影響后期種植體的骨結合。但是也有實驗研究發現DBBM應用于位點保存及上頜竇提升術中不影響種植體的骨結合[23-24]。Piattelli等[25]的研究發現DBBM用于上頜竇提升后6個月移植物顆粒大部分被成熟的致密骨包圍，與新骨之間不存在間隙，有良好的骨整合。本實驗3種移植材料剩余顆粒的比例無統計學差異，種植術后3個月的組織學結果也表明，移植骨材料的3組與空白組相比種植體的結合率都更高，組間無差異，說明3種骨移植材料均不會對后期種植體的骨結合產生不利影響，而是提高了種植體骨結合率。

綜上所述，拔牙后進行位點保存既有助于保存牙槽嵴形態，對后期種植體骨結合也有積極作用。但本實驗樣本量較小，還需進一步研究證實。